ВЫДЕЛЕНИЕ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК — КиберПедия 

Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций...

Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого...

ВЫДЕЛЕНИЕ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК



Мононуклеарные клетки выделяют (рис. 2.2, см. также цв. вклейку) из периферической крови человека по методу Boyum (1968), основанному на седиментации в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-урографина. Фиколл в данной смеси выступает как агент, агрегирующий эритроциты, а изопак (или урографин) нужен для создания изотоничности и плотности 1,077 г/см3.

Принцип метода.Гепаринизированную кровь разводят в 3 раза культуральной средой и аккуратно наслаивают на градиент фиколлурографина. Кровь задерживается над фиколлом и не смешивается с ним. Постепенно эритроциты склеиваются фиколлом и опускаются на дно пробирки. Гранулоциты, имеющие плотность большую, чем седиментирующий раствор, оседают вместе с эритроцитами. Лимфоциты вместе с моноцитами остаются в интерфазе, их собирают, переносят в другую пробирку и отмывают центрифугированием.

Метод не дает выхода более 90% клеток.

Рис. 2.2.Выделение мононуклеарных клеток в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-урографина

Лабораторная работа 2-1

1. 10 мл гепаринизированной крови человека (20-25 ЕД гепарина на 1 мл крови) разводят в 3 раза (1 часть крови и 2 части питательной среды 199).

2. Разведенную кровь наслаивают на раствор фиколл-урографина (плотность 1,077 г/см3) в соотношении 1:3 (1 часть фиколла и 3 части разведенной крови). Кровь остается над раствором фиколла и не смешивается с ним.

3. Проводят центрифугирование при комнатной температуре в течение 45 мин на центрифуге с горизонтальным ротором при 400 g.

Следует иметь в виду, что для определения необходимого числа оборотов в конкретных условиях центрифугирования или получения соответствующего центробежного ускорения одну из необходимых величин (ускорение или число оборотов) находят по формуле:

где g - центробежное ускорение; n - число оборотов в минуту; r - радиус от центра оси до границы разделяемых сред.

4. После центрифугирования собирают интерфазное кольцо, содержащее мононуклеарные клетки, в отдельную пробирку. Эритроциты склеиваются фиколлом и оседают на дно пробирки вместе с гранулоцитами (см. рис. 2.2).

5. Суспензию мононуклеарных клеток трижды отмывают средой 199, центрифугируя по 10 мин при 200 g.

 

6. Клетки ресуспендируют в 1 мл культуральной среды. Подсчет клеток осуществляют в камере Горяева. Жизнеспособность клеток определяют с помощью 0,1% раствора трипанового синего. Необходимо подсчитать процент выхода жизнеспособности клеток (более 90%). Для этого подсчитывают начальное количество клеток и количество выделенных клеток.



2.3. ВЫДЕЛЕНИЕ МОНОЦИТОВ

Лабораторные методы выделения моноцитов разнообразны, но основные методические приемы преимущественно связаны с фракционированием моноцитов по способности прилипать к стеклу или пластиковой поверхности или по способности при центрифугировании к локализации в определенных зонах ступенчатого градиента.






Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций...

Папиллярные узоры пальцев рук - маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни...

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰)...

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим...



© cyberpedia.su 2017 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав

0.005 с.