Индивидуальные и групповые автопоилки: для животных. Схемы и конструкции...
Автоматическое растормаживание колес: Тормозные устройства колес предназначены для уменьшения длины пробега и улучшения маневрирования ВС при...
Топ:
Установка замедленного коксования: Чем выше температура и ниже давление, тем место разрыва углеродной цепи всё больше смещается к её концу и значительно возрастает...
Проблема типологии научных революций: Глобальные научные революции и типы научной рациональности...
Особенности труда и отдыха в условиях низких температур: К работам при низких температурах на открытом воздухе и в не отапливаемых помещениях допускаются лица не моложе 18 лет, прошедшие...
Интересное:
Берегоукрепление оползневых склонов: На прибрежных склонах основной причиной развития оползневых процессов является подмыв водами рек естественных склонов...
Как мы говорим и как мы слушаем: общение можно сравнить с огромным зонтиком, под которым скрыто все...
Мероприятия для защиты от морозного пучения грунтов: Инженерная защита от морозного (криогенного) пучения грунтов необходима для легких малоэтажных зданий и других сооружений...
Дисциплины:
2021-04-18 | 74 |
5.00
из
|
Заказать работу |
|
|
Введение
Цианобактерии, представляющие главный источник фотосинтетической продукции в биосфере, нуждаются в ионах железа в качестве кофакторов фотосинтетической и дыхательной электрон-транспортных цепей, а также многих других клеточных функций. В связи с этим изучение генетической регуляции систем транспорта и гомеостаза железа у фотосинтезирующих организмов имеет большое фундаментальное и практическое значение. Широко известным модельным объектом молекулярной генетики фотосинтезирующих организмов является одноклеточная цианобактерия Synechocystis sp. PCC 6803 (далее Synechocystis 6803). Благодаря современным подходам биоинформатики и активному применению ДНК-микроэррей анализа, у Synechocystis 6803 выявлены гены предполагаемых систем транспорта железа (Katoh et al., 2001), в том числе гены, индуцируемые недостатком железа в среде (Houot et al., 2007). Однако функции многих из них не идентифицированы и их регуляция остается мало изученной. Известным глобальным регулятором гомеостаза железа у бактерий является ген fur, гомолог которого присутствует и у цианобактерий. Однако у цианобактерий этот ген является жизненно важным, вследствие чего выяснить его функцию с помощью инактивации до сих пор не удавалось. В нашей лаборатории сконструированы условные мутанты с инактивированным геном fur, которыев настоящее время служат объектом активных исследований. Вместе с тем важным является вопрос о регуляции самого гена fur, в чем может участвовать недавно обнаруженная антисмысловая РНК asFur.
Цель работы заключалась в изучении роли гена fur и гена его антисмысловой РНК в регуляции генов транспорта железа у цианобактерии Synechocystis sp. PCC6803. В связи с этим были поставлены следующие задачи.
|
1. Сконструировать мутанты Synechocystis 6803 с дополнительной регулируемой копией гена asFur для анализа функции этого гена.
2. Охарактеризовать мутант Synechocystis 6803 с дополнительной регулируемой копией гена asFur.
3. Изучить характер экспрессии ряда генов предполагаемого fur -регулона у мутантов с регулируемым геном fur и у мутантов с дополнительной регулируемой копией гена asFur.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Роль гена fur в гомеостазе железа и регуляции стрессового ответа у бактерий
Металлы служат необходимыми для клетки макро- и микроэлементами. К макроэлементам относятся натрий, калий, магний и кальций, к микроэлементам – часть переходных металлов, среди которых наиболее распространены железо, цинк, медь и марганец и реже встречаются кобальт, никель, молибден, хром и ванадий (Rosakis, 2004). Потребность в металлах широко варьирует у разных бактерий, однако их внутриклеточная концентрация строго контролируется на определенном уровне, поскольку как их недостаток (голодание), так и избыток (токсичный эффект) вреден для клетки. Железо, наряду с цинком и магнием, необходимо для всех микроорганизмов, за исключением некоторых молочнокислых бактерий и спирохет рода Borrelia (Posey, Gherardini, 2000). В основном железо присутствует в белках, содержащих гем и железосерные кластеры; при этом железосодержащие белки выполняют функции переносчиков электронов, катализаторов ферментативных реакций, а также регуляторов экспрессии генов, выступая в роли сенсоров внешних и внутренних условий клетки (Lill, 2009).
Многие микроэлементы, играющие важную роль в метаболизме бактерий, труднодоступны в природе. Например, недостаток железа является ограничивающим фактором первичной продуктивности океана (Coale et al., 1996), а его доступность в организме-хозяине (растении или животном) служит определяющим условием размножения патогенных бактерий (Nairz et al., 2010). Для выживания в условиях недостатка железа клетки развили ряд ответов, таких как уменьшение размера, сокращение числа вторичных метаболитов, синтез альтернативных белков (замещающих железосодержащие) и включение разнообразных механизмов эффективного поглощения железа из окружающей среды. Такие стратегии гомеостаза предполагают тонкую настройку экспрессии генов для физиологической адаптации клеток к изменяющейся концентрации металлов и предотвращения синтеза токсичных метаболитов. Железо, например, катализирует в реакции Фентона образование наиболее реакционноспособной и токсичной для клетки активной формы кислорода (АФК), гидроксильного радикала (Imlay, 2003). Физиолого-биохимические и генетические исследования доказывают прямую связь развития окислительного стресса с увеличением пула свободного внутриклеточного железа, как ординарным, так и вследствие нарушения гомеостаза этого металла (Touati, 2000; Latifi et al., 2005; Cornelis et al., 2011). В связи с этим у аэробных организмов имеет место координация гомеостаза железа и адаптивного ответа на окислительный стресс, и данную функцию у многих бактерий выполняет ген fur (ferric uptake regulator). То же название имеет суперсемейство родственных регуляторных белков, транскрипционных факторов, вовлеченных в регуляцию экспрессии генов гомеостаза металлов и стрессового ответа клетки (Табл. 1).
|
Таблица 1.
Типичные представители регуляторных белков суперсемейства FUR*
Белок | Основной адаптивный ответ | Металл-кофактор | Структурный металл |
Fur | Гомеостаз металла | Fe2+ | Zn2+ |
Zur | Zn2+ | Zn2+ | |
Nur | Ni2+ | Zn2+ | |
Mur | Mn2+ | – | |
PerR | Окислительный стресс | Fe2+ | Zn2+ |
Irr | Усвоение гема | Fe2+/гем | – |
*Использованы данные из работы (Fillat, 2014)
Введение
Цианобактерии, представляющие главный источник фотосинтетической продукции в биосфере, нуждаются в ионах железа в качестве кофакторов фотосинтетической и дыхательной электрон-транспортных цепей, а также многих других клеточных функций. В связи с этим изучение генетической регуляции систем транспорта и гомеостаза железа у фотосинтезирующих организмов имеет большое фундаментальное и практическое значение. Широко известным модельным объектом молекулярной генетики фотосинтезирующих организмов является одноклеточная цианобактерия Synechocystis sp. PCC 6803 (далее Synechocystis 6803). Благодаря современным подходам биоинформатики и активному применению ДНК-микроэррей анализа, у Synechocystis 6803 выявлены гены предполагаемых систем транспорта железа (Katoh et al., 2001), в том числе гены, индуцируемые недостатком железа в среде (Houot et al., 2007). Однако функции многих из них не идентифицированы и их регуляция остается мало изученной. Известным глобальным регулятором гомеостаза железа у бактерий является ген fur, гомолог которого присутствует и у цианобактерий. Однако у цианобактерий этот ген является жизненно важным, вследствие чего выяснить его функцию с помощью инактивации до сих пор не удавалось. В нашей лаборатории сконструированы условные мутанты с инактивированным геном fur, которыев настоящее время служат объектом активных исследований. Вместе с тем важным является вопрос о регуляции самого гена fur, в чем может участвовать недавно обнаруженная антисмысловая РНК asFur.
|
Цель работы заключалась в изучении роли гена fur и гена его антисмысловой РНК в регуляции генов транспорта железа у цианобактерии Synechocystis sp. PCC6803. В связи с этим были поставлены следующие задачи.
1. Сконструировать мутанты Synechocystis 6803 с дополнительной регулируемой копией гена asFur для анализа функции этого гена.
2. Охарактеризовать мутант Synechocystis 6803 с дополнительной регулируемой копией гена asFur.
3. Изучить характер экспрессии ряда генов предполагаемого fur -регулона у мутантов с регулируемым геном fur и у мутантов с дополнительной регулируемой копией гена asFur.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Роль гена fur в гомеостазе железа и регуляции стрессового ответа у бактерий
Металлы служат необходимыми для клетки макро- и микроэлементами. К макроэлементам относятся натрий, калий, магний и кальций, к микроэлементам – часть переходных металлов, среди которых наиболее распространены железо, цинк, медь и марганец и реже встречаются кобальт, никель, молибден, хром и ванадий (Rosakis, 2004). Потребность в металлах широко варьирует у разных бактерий, однако их внутриклеточная концентрация строго контролируется на определенном уровне, поскольку как их недостаток (голодание), так и избыток (токсичный эффект) вреден для клетки. Железо, наряду с цинком и магнием, необходимо для всех микроорганизмов, за исключением некоторых молочнокислых бактерий и спирохет рода Borrelia (Posey, Gherardini, 2000). В основном железо присутствует в белках, содержащих гем и железосерные кластеры; при этом железосодержащие белки выполняют функции переносчиков электронов, катализаторов ферментативных реакций, а также регуляторов экспрессии генов, выступая в роли сенсоров внешних и внутренних условий клетки (Lill, 2009).
|
Многие микроэлементы, играющие важную роль в метаболизме бактерий, труднодоступны в природе. Например, недостаток железа является ограничивающим фактором первичной продуктивности океана (Coale et al., 1996), а его доступность в организме-хозяине (растении или животном) служит определяющим условием размножения патогенных бактерий (Nairz et al., 2010). Для выживания в условиях недостатка железа клетки развили ряд ответов, таких как уменьшение размера, сокращение числа вторичных метаболитов, синтез альтернативных белков (замещающих железосодержащие) и включение разнообразных механизмов эффективного поглощения железа из окружающей среды. Такие стратегии гомеостаза предполагают тонкую настройку экспрессии генов для физиологической адаптации клеток к изменяющейся концентрации металлов и предотвращения синтеза токсичных метаболитов. Железо, например, катализирует в реакции Фентона образование наиболее реакционноспособной и токсичной для клетки активной формы кислорода (АФК), гидроксильного радикала (Imlay, 2003). Физиолого-биохимические и генетические исследования доказывают прямую связь развития окислительного стресса с увеличением пула свободного внутриклеточного железа, как ординарным, так и вследствие нарушения гомеостаза этого металла (Touati, 2000; Latifi et al., 2005; Cornelis et al., 2011). В связи с этим у аэробных организмов имеет место координация гомеостаза железа и адаптивного ответа на окислительный стресс, и данную функцию у многих бактерий выполняет ген fur (ferric uptake regulator). То же название имеет суперсемейство родственных регуляторных белков, транскрипционных факторов, вовлеченных в регуляцию экспрессии генов гомеостаза металлов и стрессового ответа клетки (Табл. 1).
Таблица 1.
Типичные представители регуляторных белков суперсемейства FUR*
Белок | Основной адаптивный ответ | Металл-кофактор | Структурный металл |
Fur | Гомеостаз металла | Fe2+ | Zn2+ |
Zur | Zn2+ | Zn2+ | |
Nur | Ni2+ | Zn2+ | |
Mur | Mn2+ | – | |
PerR | Окислительный стресс | Fe2+ | Zn2+ |
Irr | Усвоение гема | Fe2+/гем | – |
*Использованы данные из работы (Fillat, 2014)
Основные свойства транскрипционных факторов суперсемейства FUR
Белки суперсемейства FUR широко распространены у прокариот. В настоящее время известно около 10000 последовательностей, принадлежащих 4091 видам различных бактерий и архей (Fillat, 2014). Упрощенная модель наиболее распространенного механизма действия белка Fur заключается в специфическом связывании димера Fur в комплексе с металлом-кофактором в качестве корепрессора с палиндромными А/Т богатыми последовательностями, находящимися в промоторе контролируемых генов (Bagg, Neilands, 1987). Связывание кофактора вызывает конформационные изменения белка-регулятора, что способствует его стабильному взаимодействию с ДНК. Несмотря на структурные различия, белки суперсемейства имеют общие черты строения. На N-конце они содержат ДНК-связывающий домен, а на С-конце – регуляторный металл-связывающий участок, способный к димеризации (рис. 1; Pohl et al., 2003). Как правило, белки этого суперсемейства содержат богатую гистидиновыми остатками область HHHXHX2CX2C, расположенную в начале димеризационного домена – после шарнирной области между N-концевым ДНК-связывающим доменом и С-концом (http://pfam.xfam.org/family/PF01475). Менее консервативный мотив CXXC находится на С-конце некоторых ортологов белка Fur, а также у всех белков Zur и PerR, идентифицированных к настоящему времени.
|
Белки суперсемейства FUR обычно регулируют экспрессию собственного гена; однако, обнаружены и другие факторы, влияющие на уровень их внутриклеточной концентрации. Как правило, в клетке активно несколько белков данного семейства с различными функциями (Hantke, 2001; Fuangthong, Helmann, 2003; Botello-Morte et al., 2013), и в связи с этим часто образуются функционально значимые перекрывания регуляторных областей генов, кодирующих эти белки (Horsburgh et al., 2001; Fuangthong et al., 2002; Hernandez et al., 2004; Hohle, O’Brian, 2010).
Наиболее активно исследуемыми и хорошо изученными представителями описываемого суперсемейства являются белки Fur (прототип семейства с огромным количеством ортологов), основная функция которых заключается в регуляции поглощения клеткой железа.
|
|
Адаптации растений и животных к жизни в горах: Большое значение для жизни организмов в горах имеют степень расчленения, крутизна и экспозиционные различия склонов...
Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим...
Эмиссия газов от очистных сооружений канализации: В последние годы внимание мирового сообщества сосредоточено на экологических проблемах...
Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰)...
© cyberpedia.su 2017-2024 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав. Мы поможем в написании вашей работы!