Выращивание и извлечение алкалоидов спорыньи

Выращивание и извлечение алкалоидов спорыньи
Делаем культуральную среду, смешивая следующие компоненты с 500мл
дистиллированной воды в 2л узкогорлой колбе:
Ca(NO3)2 - 1g
KH2PO4 - 0,25g MgSO4 - 0,25g KCl - 0,125g
Fe2(SO4)3*6H2O - 8,34mg ZnSO4 - 3,44mg
сахароза - 100g
мука куриных эмбрионов - 50g

Затем довести объем среды до 1л устанавливая pH4 с помощью раствора NH4OH и лимонной кислоты. Приготовленная среда стерилизуется в автоклаве. Далее засевают среду предварительно обработанной (как в методе Грегера и Ерге) культурой Claviceps purpurea. Потом затыкается это дело пробкой из стерильного хлопка и инкубируется 2 недели. Периодически проверяют pH и поддерживают его в районе pH4.
Через 2 недели культура будет визуально наблюдатся;) Это маточная среда. Берем несколько одинаковых емкостей(колб) объемом на 1 галон с резиновой пробкой. В пробке делаем 2 отверстия, в которые вставляем 2 стеклянные трубки - короткую и длинную. В верхнюю часть длинной вставляют пробку-фильтр из стерильного хлопка и резиновой трубкой подсоединяют к компрессору (для аквариумов). Короткую трубку присоединяют (через резиновую) к длинной трубке колбы Эрленмейра, которая также с двумя стеклянными трубками разной длины и в которой находится гипохлорид натрия.
Таким макаром среда с культурой C.purpurea успешно аэрируется (т.к. они аэробы) и поддерживается чистота культуры.
Но это все потом. Сначала ферментер разбираем и, упаковав в крафт-пакеты, стерилизуем в автоклаве. 1-галонные колбы заполняются средой тогоже состава на 2/3 - 3/4 объема и тоже автоклавируются. Делее в стерильных условиях заражаем 1-галонные колбы маточной средой, собираем ферментер и включаем компрессор. Должны наблюдатся пузырьки воздуха, проходящие через культуральную среду. Оставляем процесс на 10 дней при t=25"C в достаточно темном месте.
Через 10 дней делаем культуральную среду 1% спиртовой, добавив соответствующее количество 95% этанола. Оставляем еще на 2 недели. После 24 дней выращивание прекращают. добавляют к среде 2% винную к-ту, перемешивают и оставляют на час. Затем защелачивают раствор до pH9 с помощью NH4OH и экстрагируют алкалоиды бензолом или смесью хлороформа и изобутанола. После снова экстрактируют 2% спиртовым р-ром винной к-ты и сушат под вакуумом. Получаем тартрат алкалоидов наиболее подходящую для хранения форму. Перед дальнейшим синтезом их необходимо перевести в свободную форму.
От себя хочется добавить, что стерилизации входящего воздуха лучше использовать бактерицидную лампу, помещенную в трубу. Помоему так
надежней.

Метод количественного определения эрготамина в спорынье

Метод количественного определения эрготамина в спорынье
Порошок спорыньи обезжиривают петролейным эфиром в аппарате Сокслета; из обезжиренной спорыньи алкалоиды экстрагируют диэтиловым эфиром. Разделение алкалоидов проводят хроматографией на бумаге, импрегнированной формамидом, в системе бензолпетролейный эфир (6:1). Эрготамин с бумаги элуируют 1% водным рром винной к-ты. (нужный сектор видимо определяют УФ-освещением) Содержание его в элюате определяют колориметрическим методом с раствором n-диметиламинобензальдегида в серной к-те. Колориметрирование проводят на фотоэлектроколориметре (ФЭК). Точность +-5,5%
По поводу петролейного эфира. Это смесь фракций C5 - C6 t кип 2060"CC5 фракция: н-пентан(t кип=36"C), изопентан(t кип=28"C), неопентан(t кип=9.5"C)
Наиболее высокое содержание алкалоидов отмечено для спорыньи, паразитирующей на пырее, житняке, еже сборной, лисохвосте луговом. Эти и многие другие растения я скоро выложу в виде инет атласа-определителя высших растений. Безалкалоидная раса спорыньи паразитирует на мышее(?), райграсе, паспалум(спорное заявление). На лисохвосте луговом паразитирует раса, продуцирующая в большом количестве эргозин (40-80% от суммы). Исследования спорыньи с пшенично-пырейных и ржано-пырейных гибридов показали, что, как и на ржаной спорынье, паразитируют, главным образом, безалкалоидные расы(?).

Химическое изучение алалоидов дикорастущей и культивируемой спорыньи.
Взято из Ленинской библиотеки. Дню рождения В.И.Ленина посвящается.
Метод получения диэтиламида d-лизергиновой кислоты из суммы алкалоидов спорыньи.
Баньковская А.Н., "Химическое изучение
алалоидов дикорастущей и культивируемой спорыньи и разработка методов получения препаратов.", М., 1966г. шифр: Др
.
..Для повышения выхода продукта и получения более чистого препарата нами были внесены изменения на стадии получения гидразида рацемической изолизергиновой к-ты. Для отделения гидразида рацемической изолизергиновой к-ты от пептидной части молекулы алкалоидов, мы применили дополнительную обработку гидразингидратом и абсолютным спиртом. Гидразид в этом случае получается более чистый и выходы на последующих стадиях значительно выше.
Стадии получения:
1. Получение гидразида рацемической изолизергиновой кислоты;
2. Получение гидразида d-изолизергиновой кислоты;
3. Получение азида d-изолизергиновой кислоты;
4. Получение диэтиламида d-лизергиновой кислоты.

Применение в качестве исходного сырья суммы алкалоидов, а не эрготамина, а также введение дополнительной обработки на первой стадии получения, позволили повысить выход продукта и значительно снизить его стоимость...
Схема:
сумма алкалоидов спорыньи + гидразина гидрат(t) d-C15H15N2-CO-NH-R + NH2-NH2 (+кипячение в абсолютном спирте) -> ->гидразид рацемической изолизергиновой кислоты d,l-C15H15N2-CO-NH-NH2 + ди-(n-толуил)-l-винная кислота -> ->гидразид d-изолизергиновой к-ты + азотистая к-та d-C15H15N2-CO-NH-NH2 + HNO2(HCl+NaNO2 t=0"C) ->азид экстагируют эфиром, эфирный слой высушивают (вакуум?)-> ->азид d-изолизергиновой кислоты + диэтиламин d-C15H15N2-CON3 + HN(C2H5)2 -> рацемат из 50% диэтиламида d-лизергиновой к-ты и 50% диэтиламида d-изолизергиновой к-ты.

Все. Далее видимо экстракция в бензол или эфир, подсушивание безводным Na2SO4, фильтрация и получение тартрата, путем титрования винной к-ой под контролем индикатора. Да, и необходимо соблюдать световой режим: на всех стадиях, кроме последней, - красный свет, на последней - желтый.
P.S.: похоже все содрано у Хоффмана. В 27 декабря 1965г она, ее муж и сотоварищи подала заявку на авторское свидетельство №970325 "Способ получения диэтиламида d-лизергиновой к-ты"

Метод получения препарата "эрготамин тартрат" из рожков спорыньи.

Выведение индивидуальных алкалоидов спорыньи представляет трудности из-за их большой чувствительности к воздействию кислот и щелочей, света, t, кислорода, воздуха. На основе проведенных исследований...

Метод получения препарата "эрготамин тартрат" из рожков спорыньи эрготаминового штамма

Выведение индивидуальных алкалоидов спорыньи представляет трудности из-за их большой чувствительности к воздействию кислот и щелочей, света, t, кислорода, воздуха. На основе проведенных исследований нами предложен метод получения алкалоида основанный на извлечении их из сырья дихлорэтаном без предварительного обезжиривания. Из дихлорэтанового экстракта алкалоиды извлекают 2% р-ром винной кислоты. Из винного извлечения алкалоиды после подщелачивания экстрагируют хлороформом, растворитель упаривают и алкалоиды осаждают петролейным эфиром. выходы на отдельных стадиях:
Измельчение растительного сырья 92,6%
Экстракция алкалоидов из сырья дихлорэтаном 93,3%
Извлечение алкалоидов винной кислотой 97,5%
Получение суммы алкалоидов 89,3%
Общий выход 81,25%

В связи с тем, что эрготамина тартрат нельзя перекристализовать, т.к. при нагревании в растворах он переходит в правовращающий изомер эрготаминин, для освобождения от сопутствующих алкалоидов и баластных веществ добавлены следующие этапы:
Получение сульфата
Экстракция в бензол
Экстракция в воду+ацетон
Получение тартрата
Общий выход 52,5%