Оценка интенсивности дыхания спермиев ( no H. П. Шергину).

Метод основан на следующем: спермин используют кислород раствора метиленовой сини, добавленного в сперму, которая в результате этого обес­цвечивается.

Порядок работы

На чистое предметное стекло глазной пипеткой наносят каплю свежеполученной спермы быка, барана или птицы и другой пи­петкой добавляют каплю 0,01%-го раствора метиленовой сини, приго­товленного на физиологическом растворе; капли быстро смешивают и набирают в стеклянную трубочку (капилляр), чтобы столбик был дли­ной около 2 см. Трубочку кладут на лист белой бумаги и определяют по секундомеру время, в течение которого голубой столбик обесцвечи­вается. Пробу ставят при температуре 20...22º С (табл.5).

 

Таблица 5

Оценка качества спермы по времени обесцвечивания метиленовой сини

 

Производитель	Время обесцвечивания спермы,мин
	хорошей	среднего качества	плохой (непригодной для искусственного осеменения)
Бык	5…10	11…30	Более 30
Баран	3…7	8…12	Более 12
Петух	3…4	-	-
Гусак	7…9	-	-
Индюк	4…5	-	-

Чем интенсивнее поглощается кислород, тем быстрее обеспечивает­ся краситель, тем выше выживаемость и оплодотворяющая способ­ность спермиев. У жеребца и хряка реакция длится до 60 мин, поэтому спермии у данных животных этим способом не оценивают.

Определение рН спермы.

Концентрацию водородных ионов – рН, определяют электрометрическим методом или универсальными (бумажными) индикаторами по изменению их цвета в зависимости от кислотности среды. Методика изложена в инструкциях по работе с индикаторами. Изменение рН спермы быка и барана в щелочную сторону (рН 7,1) указывает на плохое качество спермы, в кислую (рН 6,5) – на накопление в ней молочной кислоты, pH 6,9-7,0 спермы жеребца и хряка свидетельствуют о хорошем качестве спермы, рН 7,8-8,0 – о низкой жизнеспособности спермиев.

 

Определение процента живых и мертвых спермиев.

Оболочка спермиев, у которых энергично протекают обменные процессы, не пропускает в протоплазму некоторые лабораторные краски. Поэтому живые, подвижные спермии не окрашиваются (в поле зрения микроскопа они хорошо отличаются бледной, неокрашенной головкой), тогда как мертвые и ослабленные с колебательным движением спермии легко пропускают краску внутрь клеток и окрашиваются теми же красками. 

Порядок работы

На обезжиренное спиртом и эфиром стекло наносят небольшую каплю спермы, добавляют к ней каплю 5%-го водного раствора эозина, в течение 1-2 с. смешивают и делают тонкий мазок на предметном стекле. Мазок быстро высыхает на воздухе. Краску готовят на 3%-м растворе цитрата натрия. Для спермы жеребца можно использовать 1%-й конго-рот, приготовленный на 7%-м растворе глюкозы. Высохший мазок просматривают под микроскопом при увеличении в 400-600 раз. Спермии, бывшие в момент смешивания с краской живыми, хорошо выделяются на розовом фоне своей белой головкой. Мертвые спермии окрашиваются в розовый цвет. Подсчитывают 500 спермиев подряд, отмечая число окрашенных, и вычисляют процент живых и мертвых по формуле:

П = Ж × 100 / 500,

 

где П – процент живых спермиев; Ж – число живых спермиев; 100 – пересчет на проценты; 500 – общее число посчитанных спермиев. Полученный результат выражают по активности спермиев в баллах.

 

Определение выживаемости спермиев.

Выживаемость спермиев – это продолжительность их жизни вне организма при определенных условиях. Чем дольше остаются спермии живыми во внешней среде, тем продолжительней их жизнь в половых путях самки, следовательно, для них характерна высокая оплодотворяющая способность.

       На станциях искусственного осеменения, где сперма хранится в течение 3 суток, выживаемость спермиев определяют в течение всего срока использования спермы, благодаря чему удается выявить снижение активности ниже допустимого уровня. Хорошая сперма сохраняет активность (при температуре хранения от 0°С до +4°С) не ниже 6 баллов в течение 3 суток.

Порядок работы

Сперму разбавляют следующим образом. Берут одиннадцать пронумерованных пробирок. В первую вносят 0,5 мл неразбавленной спермы, в остальные десять – по 0,5 мл разбавителя. Затем во вторую пробирку наливают 0,5 мл неразбавленной спермы. Перемешав содержимое второй пробирки, из нее берут 0,5 мл смеси и переносят в третью пробирку. Перемешав, 0,5 мл смеси из третьей пробирки переносят в четвертую пробирку и так продолжают до последней. В первой пробирке остается неразбавленная сперма, а в остальных – разбавленная в 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, и 1024 раза (из последней, 11-й пробирки 0,5 мл смеси убирают).

       В пробирках сразу и в последующие дни ежедневно под микроскопом оценивают подвижность спермиев (в одно и то же время) при температуре 40° С, смешивая при этом каплю спермы (смеси) из пробирки с каплей 2,9%-го раствора цитрата натрия

       Результаты записывают в таблицу и оценивают подвижность спермиев до полного прекращения их поступательного движения.

       Абсолютный показатель выживаемости вычисляют по формуле:

 

S = ∑ at; t = ^{T n +1 – T n -1}

                             ²

где S – абсолютный показатель выживаемости спермиев; а – активность спермиев; t – показатель времени, вычесленный по формуле; Т_n+1 – время в часах от начала опыта до последующего определения активности; Т_n-1 - время в часах от начала опыта до предыдущего определения активности.

       Чем выше абсолютный показатель живучести спермы, тем выше качество спермы и разбавителя.

       Высокое качество спермы характеризуется следующими требованиями:

1. подвижность спермиев в течение 2 – 3 суток должна быть 0,7 – 0,8 балла (при начальной оценке спермы 1 – 0,9);
2. оптимум разбавления спермы не менее 8 – 16 раз;
3. резистентность не ниже 10 000;
4. абсолютный показатель живучести не ниже 120 (он может достигать и до 400);
5. продолжительность жизни спермиев при 0º должна сохраняться 10 – 14 суток (до прекращения не только прямолинейно-поступательного, но и колебательного движения спермиев).

Однако следует иметь в виду, что, несмотря на способность спермиев сохранять жизнь до 10 – 14 суток, оплодотворяющую способность они теряют значительно раньше. Поэтому при искусственном осеменении обычно допускается хранение разбавленной спермы при 0º не более 3 суток.

Аналогично можно определять живучесть спермы жеребца и хряка.

Изучение выживаемости спермиев жеребца проводят только в разбавленной сперме, так как в неразбавленной сперме вследствие пагубного действия секретов придаточных желез они прекращают движение через 3-4 часа. Абсолютный показатель живучести спермы у жеребца при правильном его использовании и кормлении в среднем равен 12 – 20, а продолжительность жизни спермиев при 0º обычно колеблется от 36 до 72 часов; если менее 24 часов, то это указывает на их низкую оплодотворяющую способность.

           Хорошая сперма быка и барана, разбавленная в 16-32 раза, должна иметь показатель абсолютной выживаемости не ниже 1400, что во времени выражается 8-9 суток (иногда этот показатель достигает 4000). После 3-4 суток хранения подвижность спермиев должна быть не менее 7 баллов.

       Хорошая сперма жеребца должна иметь показатель выживаемости не менее 450, или не менее 150 часов, а подвижность спермиев не ниже 5 баллов через 3 суток. У хорошей спермы хряка показатель выживаемости не менее 900 и подвижность спермиев не ниже 6 баллов через 3 суток.