Биофизика фотобиологических процессов

Биофизика фотобиологических процессов

А.Б.Рубин, О.Р.Кольс, Т.Е.Кренделева и др.

Одной из важнейших фундаментальных проблем биофизики является расшифровка механизмов первичных процессов действия света на разные биологические системы. Свет является одним из ключевых факторов среды обитания большинства организмов. Рецепция света и трансформация его энергии лежит в основе зрения, фотосинтеза и ряда фоторегуляторных процессов у растений, в инициации которых участвуют специализированные фоторецепторы, например, родопсин, хлорофилл, фитохром, фототропин, криптохром. Поглощая свет определенного спектрального диапазона, фоторецепторы вступают в фотохимические реакции с образованием первичных фотопродуктов. Последние участвуют в биохимических процессах клеточной регуляции, что приводит к развитию конечных фотобиологических эффектов. В то же время свет индуцирует протекание в клеточных структурах различных деструктивных фотохимических реакций, природа и эффективность которых зависит от длины волны и интенсивности излучения, наличия соответствующих фотоактивных хромофоров и их внутриклеточной локализации, а также способности клеток к фотозащите и репарации фотоповреждений. Наиболее эффективно деструктивные реакции индуцируются высокоэнергетическим ультрафиолетовым (УФ) излучением (‹290 нм). Экологическими компонентами оптического излучения солнца яаляются средневолновый УФ (СУФ, 290—320 нм), длинноволновый УФ (ДУФ, 320—400 нм) и видимый свет (400—700 нм). Уменьшение концентрации стратосферного озона ведет к повышению интенсивности СУФ, который за счет прямого поглощения нуклеиновыми кислотами и белками вызывает образование в них повреждений, обусловливающих цитотоксические, мутагенные и канцерогенные эффекты. ДУФ и видимый свет, которые макромолекулами непосредственно не поглощаются, могут индуцировать деструктивные реакции за счет фотосенсибилизации с участием эндогенных и экзогенных сенсибилизаторов (хромофоров), способных в фотовозбужденном состоянии реагировать с биосубстратами с образованием реакционноспособных радикалов или генерировать активные формы кислорода, вызывающие окислительный стресс.

Молекулярная фотобиология

Исследования в этой области связаны с изучением фундаментальных механизмов воздействия света на клетки дрожжей и бактерий. Основная проблема состоит в выявлении фотоиндуцированных реакций и изучении природы светочувствительности живой клетки при воздействии оптического излучения. В центре внимания — экспериментальное решение следующих вопросов:

какие потенциально фотоактивные хромофоры (сенсибилизаторы) могут вступать в фотохимические реакции в клетке, не содержащей специализированные фоторецепторные системы;

какова природа первичных фотопродуктов, ответственных за развитие конечного фотобиологического эффекта;

какое значение для протекания фотореакций и проявления эффекта имеют внутриклеточная локализация фотоактивного хромофора и его молекулярное микроокружение;

какие механизмы могут лежать в основе фотоиндуцированной модификации цитотоксических эффектов оптического излучения, которая наблюдается при комбинированных воздействиях света разной длины волны и интенсивности.

Исследования, проведенные на клетках дрожжей, позволили обнаружить, что низкоинтенсивный монохроматический свет в диапазоне 290—380 нм индуцирует два различных фотобиологических эффекта в зависимости от дозы облучения: фотозащиту от УФ-инактивации и фотостимуляцию размножения клеток. Оба эффекта основаны на фотомодуляции активности фермента, катализирующего синтез серотонина — метаболита, у которого были обнаружены ранее не известные функции — протектора ДНК от УФ-повреждений и регулятора клеточного деления. При более высоких интенсивностях и дозах ДУФ- излучение вызывает летальный эффект, в основе которого лежат фотодинамические реакции. Показано, что функцию эндогенного сенсибилизатора выполняет локализованный в ядре клетки НАДН. Установлена способность НАДН фотогенерировать супероксидный анион-радикал кислорода с последующим образованием перекиси водорода и гидроксильного радикала, который непосредственно участвует в формировании одноцепочечных разрывов ДНК. Кратковременное воздействие видимого света в малых дозах (максимум эффективности в красной области спектра при 680 нм) индуцирует защитный эффект в условиях инактивирующего облучения клеток СУФ и ДУФ. Установлено цитотоксическое действие видимого света, опосредованное эндогенным сенсибилизатором протопорфирином. В условиях индуцированного накопления в митохондриях клетки высокого уровня сенсибилизатора и последующей его релокализации в плазматическую мембрану и ядро наблюдается многократное увеличение летального эффекта вследствие взаимодействия деструктивных процессов, протекающих в этих структурах.

В качестве первоочередной задачи при изучении молекулярного механизма обнаруженного фотозащитного эффекта, индуцированного красным светом, необходима идентификация фоторецептора, опосредующего этот эффект. Полученные ранее данные дают основания предполагать, что фоторецептором в дрожжевой клетке может служить хромопротеид, аналогичный фитохрому — универсальному фоторегуляторному пигменту растений. У микроорганизмов функциональная роль фитохрома пока не определена, хотя гены, кодирующие апофитохром, недавно найдены у некоторых бактерий и грибов. Другая задача связана с изучением молекулярных основ фотосенсибилизирующей активности и фотолабильности эндогенного протопорфирина, участвующего в фотодинамической инактивации дрожжевых клеток, в зависимости от молекулярного микроокружения.

Бактериородопсин

Эволюционно наиболее ранним фотопреобразующим комплексом является белок бактериородопсин, осуществляющий светоиндуцированный трансмембранный перенос протонов, создающих «движущую силу» для последующего синтеза АТФ. Этот белок, выполняющий в настоящее время функцию так называемого «бесхлорофильного» фотосинтеза у некоторых видов архебактерий, чрезвычайно устойчив к различным воздействиям. Физические механизмы функционирования данного фотопреобразующего комплекса привлекают самое пристальное внимание исследователей в течение последних десятилетий.

В проводимых на кафедре биофизики работах было показано, что конформационная подвижность фототрансформирующих белков, как и в случае классических ферментов, играет ключевую роль в их функционировании. Ее роль проявляется, начиная с пикосекундных стадий переноса электрона, в которых микроконформационная динамика обеспечивает быстрые релаксационные процессы, сопровождающие эффективную временную стабилизацию первичного разделения заряда. Гораздо более медленные конформационные изменения, приводящие к формированию выделенных структурных состояний макромолекулярного комплекса, контролируют направленность и скорость дальнейшего переноса зарядов. Была показана важнейшая роль состояния внутримолекулярных водородных связей в указанных процессах.

Детальное изучение влияния температурного фактора на первичные фотофизические процессы превращения световой энергии позволило сформулировать концепцию фотоконформационного перехода как эффективного механизма регуляции скорости переноса электронов в фоточувствительной макромолекулярной структуре.

Иммобилизация этих белков в полимерных матрицах, формирование на их основе тонких ориентированных пленочных структур, включение полупроводниковых и других электропроводящих компонентов в создаваемые конструкции открывает широкие возможности изучения практического применения белков РЦ и бактериородопсина. Имеется приборная база для формирования и изучения свойств упорядоченных моно- и мультислойных многокомпонентных пленочных конструкций с участием фоточувствительных белков (техника Ленгмюра- Блоджетт, атомно-силовая и туннельная микроскопия, электрохимический анализатор).

Биофизика фотобиологических процессов

А.Б.Рубин, О.Р.Кольс, Т.Е.Кренделева и др.

Одной из важнейших фундаментальных проблем биофизики является расшифровка механизмов первичных процессов действия света на разные биологические системы. Свет является одним из ключевых факторов среды обитания большинства организмов. Рецепция света и трансформация его энергии лежит в основе зрения, фотосинтеза и ряда фоторегуляторных процессов у растений, в инициации которых участвуют специализированные фоторецепторы, например, родопсин, хлорофилл, фитохром, фототропин, криптохром. Поглощая свет определенного спектрального диапазона, фоторецепторы вступают в фотохимические реакции с образованием первичных фотопродуктов. Последние участвуют в биохимических процессах клеточной регуляции, что приводит к развитию конечных фотобиологических эффектов. В то же время свет индуцирует протекание в клеточных структурах различных деструктивных фотохимических реакций, природа и эффективность которых зависит от длины волны и интенсивности излучения, наличия соответствующих фотоактивных хромофоров и их внутриклеточной локализации, а также способности клеток к фотозащите и репарации фотоповреждений. Наиболее эффективно деструктивные реакции индуцируются высокоэнергетическим ультрафиолетовым (УФ) излучением (‹290 нм). Экологическими компонентами оптического излучения солнца яаляются средневолновый УФ (СУФ, 290—320 нм), длинноволновый УФ (ДУФ, 320—400 нм) и видимый свет (400—700 нм). Уменьшение концентрации стратосферного озона ведет к повышению интенсивности СУФ, который за счет прямого поглощения нуклеиновыми кислотами и белками вызывает образование в них повреждений, обусловливающих цитотоксические, мутагенные и канцерогенные эффекты. ДУФ и видимый свет, которые макромолекулами непосредственно не поглощаются, могут индуцировать деструктивные реакции за счет фотосенсибилизации с участием эндогенных и экзогенных сенсибилизаторов (хромофоров), способных в фотовозбужденном состоянии реагировать с биосубстратами с образованием реакционноспособных радикалов или генерировать активные формы кислорода, вызывающие окислительный стресс.

Молекулярная фотобиология

Исследования в этой области связаны с изучением фундаментальных механизмов воздействия света на клетки дрожжей и бактерий. Основная проблема состоит в выявлении фотоиндуцированных реакций и изучении природы светочувствительности живой клетки при воздействии оптического излучения. В центре внимания — экспериментальное решение следующих вопросов:

какие потенциально фотоактивные хромофоры (сенсибилизаторы) могут вступать в фотохимические реакции в клетке, не содержащей специализированные фоторецепторные системы;

какова природа первичных фотопродуктов, ответственных за развитие конечного фотобиологического эффекта;

какое значение для протекания фотореакций и проявления эффекта имеют внутриклеточная локализация фотоактивного хромофора и его молекулярное микроокружение;

какие механизмы могут лежать в основе фотоиндуцированной модификации цитотоксических эффектов оптического излучения, которая наблюдается при комбинированных воздействиях света разной длины волны и интенсивности.

Исследования, проведенные на клетках дрожжей, позволили обнаружить, что низкоинтенсивный монохроматический свет в диапазоне 290—380 нм индуцирует два различных фотобиологических эффекта в зависимости от дозы облучения: фотозащиту от УФ-инактивации и фотостимуляцию размножения клеток. Оба эффекта основаны на фотомодуляции активности фермента, катализирующего синтез серотонина — метаболита, у которого были обнаружены ранее не известные функции — протектора ДНК от УФ-повреждений и регулятора клеточного деления. При более высоких интенсивностях и дозах ДУФ- излучение вызывает летальный эффект, в основе которого лежат фотодинамические реакции. Показано, что функцию эндогенного сенсибилизатора выполняет локализованный в ядре клетки НАДН. Установлена способность НАДН фотогенерировать супероксидный анион-радикал кислорода с последующим образованием перекиси водорода и гидроксильного радикала, который непосредственно участвует в формировании одноцепочечных разрывов ДНК. Кратковременное воздействие видимого света в малых дозах (максимум эффективности в красной области спектра при 680 нм) индуцирует защитный эффект в условиях инактивирующего облучения клеток СУФ и ДУФ. Установлено цитотоксическое действие видимого света, опосредованное эндогенным сенсибилизатором протопорфирином. В условиях индуцированного накопления в митохондриях клетки высокого уровня сенсибилизатора и последующей его релокализации в плазматическую мембрану и ядро наблюдается многократное увеличение летального эффекта вследствие взаимодействия деструктивных процессов, протекающих в этих структурах.

В качестве первоочередной задачи при изучении молекулярного механизма обнаруженного фотозащитного эффекта, индуцированного красным светом, необходима идентификация фоторецептора, опосредующего этот эффект. Полученные ранее данные дают основания предполагать, что фоторецептором в дрожжевой клетке может служить хромопротеид, аналогичный фитохрому — универсальному фоторегуляторному пигменту растений. У микроорганизмов функциональная роль фитохрома пока не определена, хотя гены, кодирующие апофитохром, недавно найдены у некоторых бактерий и грибов. Другая задача связана с изучением молекулярных основ фотосенсибилизирующей активности и фотолабильности эндогенного протопорфирина, участвующего в фотодинамической инактивации дрожжевых клеток, в зависимости от молекулярного микроокружения.