Лаборатория микробиологических методов исследования и техники лабораторных работ.

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НИЖЕГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ

«НИЖЕГОРОДСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ КОЛЛЕДЖ»

 

 

Лаборатория микробиологических методов исследования и техники лабораторных работ.

 

Методические рекомендации

для обучающихся по специальности 34.02.01 Сестринское дело

к проведению лабораторно – практических занятий

по дисциплине ОПД. 06 Основы микробиологии и иммунологии

 

Нижний Новгород

2017

 

Лабораторно – практическое занятие № 1

Протокол № 1

Тема: Освоение бактериологического метода исследования микроорганизмов.

Цель: Получить представление об устройстве и работе микробиологической лаборатории

Задачи:

1. Изучить правила техники безопасности
2. Приобрести знания о помещениях бактериологической лаборатории и их предназначении.
3. Приобрести навыки приготовления микробиологического мазка из жидкой культуры.
4. Приобрести навыки окрашивания по Граму.

 

Практическая часть:

Лабораторная работа № 1

«Правила техники безопасности при работе в бактериологической лаборатории»

Ход работы:

1. Ознакомиться с инструкциями №
2. Выписать в Протокол занятия основные положения Правил ТБ
3. Выучить правила техники инфекционной безопасности.

ПРАВИЛА ИНФЕКЦИОННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ

ПРИ РАБОТЕ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ.

1.    Не входить в лабораторию в верхней одежде (пальто, головном уборе) не вносить посторонние вещи.

2.    В бактериологической лаборатории запрещается принимать пищу, напитки, разговаривать по сотовому телефону.

3.    Приступать к занятиям, только надев хлопчатобумажный халат, шапочку и сменную обувь.

4.    Строго соблюдать правила обращения с химическими реактивами и красителями.

5.    С большой осторожностью пользоваться спиртами (огнеопасно!!!). 

6.    Помнить, что некоторые микроорганизмы, особенно споры грибов, являются аллергенами. Не допускать их распыления – не оставлять открытыми чашки Петри, пробирки, колбы с культурами микроорганизмов.

7.    Обязательно следить за порядком и чистотой в лаборатории и своим рабочим местом. После занятия обязательно протереть иммерсионный объектив микроскопа мягкой салфеткой, накрыть микроскоп чехлом, убрать в шкаф.

8.    Рабочее место, инструменты и лабораторную посуду вымыть и простерилизовать (по необходимости).

9.    Обязательно вымыть руки после работы в микробиологической лаборатории.

10.  Материал, поступающий в лабораторию для исследования всегда считать инфицированным / заразным. Исследуемый материал и отработанные культуры полежат уничтожению.

11.  При попадании исследуемого материала на поверхность лабораторной мебели, ее обрабатывают дезраствором, руки тщательно моют с мылом.

12.  Помнить, что студенты несут ответственность за используемые ими микроскопы, другое лабораторное оборудование, чистоту рабочего места.

13.  Перед уходом из лаборатории дежурный проводит влажную уборку помещения с дез.средством, проверяет, выключены ли вода, свет, электроприборы.

 

ПРАВИЛА ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ

ПРИ РАБОТЕ В БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

1     Перед работой убедитесь в исправности осветительных приборов и целостности проводки.

2     Работать с электроприборами разрешается сухими руками.

3     Переставлять и переносить осветительные приборы, микроскопы во включенном состоянии недопустимо.

4     Перед работой проверьте плотность прилегания штуцера к корпусу спиртовки.

5     Зажигайте спиртовку спичкой. Гасите, накрывая пламя колпачком. Не передвигайте горящую спиртовку.

 

Лабораторная работа № 2

«Устройство микробиологической лаборатории»

Медицинская бактериологическая лаборатория является одним из основных подразделений больниц, санитарно – эпидемиологических станций, научно - исследовательских институтов. Исследования в лаборатории проводятся как с диагностической, так и с научной целью. В бактериологической лаборатории выделяют «чистую» и «заразную» зоны.

В чистой зоне расположены помещения, где отсутствует контакт с биологическим материалом: гардероб, санпропускник, комната приема пищи, ординаторская, складские помещения (материальные: полотенца, вата, среды и т.д.).

       Заразная зона баклаборатории имеет ряд помещений:

1     Лабораторная комната служит для проведения бактериологических исследований.

2     Средоварня служит для приготовления и разливания питательных сред.

3     Моечная – для обработки и подготовки посуды для стерилизации.

4     Автоклавная – стерилизационная комната.

5     Бокс служит для проведения работ в асептических условиях.

6     Комната регистрации и приема материала – для анализа.

В каждой комнате должны быть раковины, стены покрыты кафелем, пол – линолеумом. Для выращивания микробов необходимы особые приборы – термостаты. Для стерилизации необходимы автоклавы и сушильные шкафы.

Оборудование рабочего стола лаборанта/санитарного фельдшера.

1     Спиртовка

2     Бактериологические петли, иглы, шпатели

3     Предметные и покровные стекла

4     Вата или марлевые салфетки

5     Мыло

6     Карандаши по стеклу

7     Спички

8     Пипетки

9     Наборы красителей: генцианвиолет, водный раствор фуксина,     раствор Люголя, Спирт 95º.

10   Колба для воды

11   Стакан или банка с дезинфицирующим раствором

12   Банка для мусора

13   Пинцеты

14   Иммерсионное масло

15   Микроскоп

16   Микробиологический мостик

17   Кристаллизатор (простоквашница)

Практическое задание:

Собрать рабочий стол лаборанта/санитарного фельдшера.

 

Лабораторная работа № 3

«Приготовление микробиологического мазка из жидкой культуры»

       На исследование мазок можно брать как из жидкой, так и из плотной культуры. Если мы работаем с плотной питательной средой, то мазок эмульгируется в капле воды. Жидкая питательная среда не требует дополнительного разведения.

Ход работы:

1. чистые сухие предметные стекла обезжирить, натерев их кусочком мыла, а затем протерев марлевой салфеткой.
2. на обезжиренное стекло нанести пипеткой каплю воды (для плотной культуры).
3. профламбировать микробиологическую петлю в пламени спиртовки (кольцо, проволочную ножку до держателя).
4. охладить петлю о стенку пробирки или крышку чашки Петри.
5. захватить петлей часть культуры
6. опустить петлю с культурой на стекло в каплю воды и тщательно растереть (эмульгировать) до гомогенного тонкого ровного слоя.
7. профламбировать петлю, сжечь остатки культуры.
8. мазок высушить на воздухе.
9. высушенный мазок зафиксировать над пламенем спиртовки (3 – 5 сек) трижды медленно проводя через пламя. На этом этапе мазок закрепляется на стекле, микробы инактивируются, убитые микроорганизмы лучше воспринимают краску.

 

Окрашивание по Граму.

       Традиционный метод окрашивания микроорганизмов, предложенный Грамом.

1. на фиксированный мазок нанести 1 – 2 капли генцианвиолета на 3 – 5 мин.
2. промыть водой, держа препарат ребром.
3. нанести раствор Люголя на 1 – 2 мин.
4. дифференцировать в этиловом спирте до почернения препарата и отхождения облачков краски 30 – 60 сек.
5. промыть водой.
6. докрасить водный раствором фуксина 30 – 60 сек.
7. тщательно промыть водой, высушить, микроскопировать с иммерсией.

       Результат окрашивания: гр+ - сине – фиолетовые, гр- красные.

 

ЗАПОМНИТЬ:

Грам-положительные микроорганизмы	Грам-отрицательные микроорганизмы
Стафилококки	Менингококки (бобовидные)
Стрептококки	Гонококки (бобовидные, в оболочке лейкоцитарной)
Пневмококки (пламя свечи)	Эшерихии (кишечная палочка)
Палочки сибирской язвы	Сальмонеллы
Палочки дифтерии	Шигеллы (дизентерия)
Палочка Коха (туберкулеза)	Холерный вибрион
Клостридии столбняка	Палочка чумы
Клостридии ботулизма	Возбудитель бруцеллеза
Клостридии (перфрингенс) газовой гангрены	Возбудитель коклюша

 

Приложение 1

 

Вопросы для контроля опорных знаний по теме:

 

1) Какие формы микроорганизмов вам известны

2) Строение бактериальной клетки

3) Строение клеточной оболочки

4) Тинкториальные свойства микроорганизмов

5) Периоды роста микроорганизмов

Приложение №2

Лабораторная работа № 1.

Подготовка лабораторной посуды к сухожаровой стерилизации.

Оснащение: крафт бумага, ватно-марлевые пробки, вата, чашки Петри, пробирки, пипетки, сухожаровой шкаф.

Ход работы:

1. Проверьте: посуда для стерилизации должна быть сухая и чистая.

2. Пробирки, флаконы, бутыли, колбы закройте ватно-марлевыми пробками. Поверх пробки на каждый сосуд (кроме пробирок) надевают бумажный колпачок. Заверните пробирки в бумагу по 10 штук в упаковке.

3. Заверните чашки Петри в бумагу по 1-5 штук так, чтобы нигде не виднелось стекло.

4. Упакуйте пастеровские пипетки по 3-5-10-15 штук. Их заворачивают в крафт бумагу, в верхнюю часть каждой пипетки вкладывают кусочек ваты. (Во время работы пипетки из пакета вынимают за верхний конец).

5. Градуированные пипетки заворачивают в полоски бумаги шириной 5-6 см (полоска располагается под углом 20⁰ – 30⁰ к пипетке, обороты бумаги плотно прилегают друг к другу).

Форма отчетности: представить преподавателю посуду, подготовленную к сухожаровой стерилизации.

 

 

Лабораторная работа №2.

Приготовление и окраска микробиологических мазков

Приготовьте два препарата из культуры, выращенной в чашке Петри, окрасьте один препарат простым способом, второй препарат – по Граму. Приготовьте препарат из зубного налета и окрасьте его по методу Грама.

Оснащение: наборы лабораторных принадлежностей для приготовления мазков и окраски препаратов. В каждый набор входит: спиртовка, спички, предметные стекла, марлевые салфетки, бактериальные петли, пинцеты, пипетки, дистиллированная вода, раствор генцианвиолета, раствор Люголя, спирт этиловый 96%, фуксин Пфейфера, хозяйственное мыло, перекись водорода 3%, ватные тампоны, поддон для слива красок, микробиологические мостики, подставки под препараты, фильтровальная бумага.

Ход работы:

Приготовление мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде:

1. Со стороны дна чашки Петри отметьте восковым карандашом участок с интересующей вас колонией бактерий.

2. Поставьте чашку перед горящей спиртовкой слева от вас.

3. Обезжирьте предметное стекло с помощью кусочка мыла и марлевой салфетки. Проведите несколько раз обезжиренную сторону через пламя спиртовки. Положите стекло на подставку перед спиртовкой обезжиренной стороной вверх.

4. Бактериальной петлей нанесите на стекло каплю дистиллированной воды (на обезжиренном стекле капля растекается).

5. Прокалите бактериальную петлю, держа её вертикально в пламени до покраснения.

6. Осторожно приоткройте чашку Петри, введите петлю.

7. Остудите петлю о крышку или стенку чашки.

8. Осторожно коснитесь петлей колонии.

9. Аккуратно выньте петлю, закройте чашку.

10. Размешайте культуру в капле на стекле. Сделайте мазок размером с двухрублевую монету.

11. Высушите мазок при комнатной температуре или в теплом воздухе над пламенем горелки (на высоте 50-60 см).

12. Зафиксируйте мазок путём трехкратного проведения над пламенем горелки.

13. Мазок окрасьте простым способом или по Граму.

14. Промыть водой.

15. Высушить фильтровальной бумагой или на воздухе.

 

Окраска препарата по Граму

 

1. Нанесите на мазок раствор генцианвиолета на 5 минут.

2. Тщательно промойте дистиллированной водой пастеровской пипеткой или промывалкой.

3. Нанесите 2-3 капли раствора Люголя на 1 минуту. Слейте.

4. Нанесите несколько капель спирта до отхождения фиолетовых капель, но не более, чем на 30 секунд.

5. Мазок тщательно промойте водой (сливая воду на ребро стекла).

7. Докрасьте мазок фуксином – 0,5 – 1 минуту.

8. Промойте водой.

9. Высушите фильтровальной бумагой.

Окраска препарата простым способом

 

1. Нанесите на препарат 2-3 капли фуксина Пфейфера на 1-2 минуты или метиленовый синий на 3-5 минут.

2. Смойте краситель водой (сливая воду на ребро стекла).

3. Высушите фильтровальной бумагой или на воздухе.

Приготовление мазка из зубного налета

 

1. Небольшое количество зубного налета снять острым концом спички или зубочисткой.

2.Растереть на предметном стекле размером с двухрублевую монету.

3. Мазок зафиксировать путём трехкратного проведения над пламенем горелки.

4. Мазок окрасить по Граму.

5. Промыть водой.

6. Высушить фильтровальной бумагой или на воздухе.

 

 

Лабораторная работа № 3.

Микроскопирование  препаратов иммерсионным способом. Определение морфологической группы бактерий.

Оснащение: микроскопы, лампы настольные, иммерсионное масло.

Ход работы:

Настройка микроскопа:

1. Поставьте микроскоп штативом к себе, на расстоянии ладони от края стола.

2. Поместите препарат на предметный столик.

3. Вращая револьвер, поставьте в рабочее положение объектив с малым увеличением (×8).

4. Глядя в окуляр, осветите с помощью зеркала поле зрения.

5. Переместите револьвер на большее увеличение (объектив ×90).

Работа с иммерсионным объективом (×90):

Первый способ:

1. Нанести на препарат каплю иммерсионного масла.

2. Объектив погрузить в каплю масла почти до упора (смотреть сбоку на предметный столик).

3. Глядя в окуляр, очень медленно вращать макровинты на себя до появления изображения.

4. Микровинтами настроить резкое изображение.

Второй способ:

1. Нанести на препарат каплю иммерсионного масла.

2. Опустить объектив в каплю масла (смотреть сбоку на предметный столик).

3. Немного приподнять объектив (сделать небольшую масляную «ножку»).

4. Глядя в окуляр, медленно опускать объектив в масло до появления изображения.

5. Микровинтами настроить резкое изображение.

 

Форма отчетности: представить преподавателю сделанные препараты; в рабочей тетради зарисовать изображение препаратов в микроскопе, указать морфологическую группу бактерий, представить преподавателю убранное и продезинфицированное рабочее место.

 

 

Лабораторно – практическое занятие № 3

Протокол № 3

Тема: Изучение микрофлоры ротовой полости

Цель: Изучить разнообразие микрофлоры биотопов ротовой полости здорового человека

Задачи:

5. закрепить навыки взятия мазков из ротовой полости;

6. - закрепить навыки работы по алгоритму микробиологических исследований;

7. - провести учет полученных результатов;

8. - освоить принципы постановки и оценки результатов антибиотикочувствительности;

9. - обеспечить инфекционную безопасность при проведении работы.

 

Практическая часть:

Лабораторная работа № 1

Изучение мазков микрофлоры ротовой полости

1.Зонд – тампоном провести по внутренней стороне щеки, не касаясь губ, зубов, десен.

2.Нанести полученный биоматериал на подготовленное предметное стекло

3. Зафиксировать полученный мазок.

4. Окрасить по Граму

 

Лабораторная работа № 2

Определение культуральных свойств микроорганизмов

 

При изучении морфологической характеристики используйте характеристики S- и R- формы колоний из данного списка:

− морщинистая, гладкая;

− блестящая, матовая;

− сухая, влажная;

− гомогенная, гетерогенная;

− круглая, неправильная форма;

− неровные края, ровные края;

− врастает в среду, находится на поверхности среды.

 

 

 

Лабораторная работа № 3

Протокол № 4

Тема: Изучение принципов иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных болезней 

Цель: Получить представление о методах иммунологических исследований.

Задачи:

1. Ознакомиться с механизмами реакций агглютинации, преципитации, связывания комплемента.

2. Ознакомиться с наиболее распространенными вакцинами и сыворотками.

Практическая работа:

Лабораторная работа № 1

Изучение иммунохимических реакций

Комплекс «антиген – антитело» образуется при взаимодействии чужеродных для нашего организма веществ с защитными белками сыворотки крови (антителами). Поэтому такие реакции называют также серологическими (serum – сыворотка).

    Существуют два вида постановки иммунохимических реакций, используемых в диагностике:

1. Для выявления количества или титра антител в сыворотке крови с помощью известного антигена (серодиагностика). В качестве стандартного антигена применяется диагностикум.

2. Для обнаружения и идентификации антигенов в биологических жидкостях при помощи известных антител (серотипирование). В качестве препарата, содержащего антитела используются диагностические сыворотки.

Общие закономерности иммунологических методов:

· исследование проводится  in vitro;

· проявляется при иммунологическом соответствии (гомологичности) антигена и антитела;

· протекают в две фазы (невидимая и видимая).

Для количественной характеристики иммунологических методов исследования используют такие понятия, как чувствительность и специфичность.

 

Чувствительность = число положительных реакций у истинных больных * 100%

                         Число обследованных больных с подтвержденным диагнозом

 

Специфичность = число отрицательных реакций в контрольной группе * 100%

                         Число обследованных в контрольной группе

        

Все иммунологические методы можно разделить на три группы:

1). Основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (феномены агглютинации, преципитации, гемагглютинации, иммобилизации и др.)

2). Основанные на опосредованном взаимодействии антигена с антителом (реакции непрямой агглютинации, коагглютинации, латекс – агглютинации, угольной агломерации, связывания комплемента и др.)

3). С использованием меченых антител или антигенов (флюоресцирующих антител, иммуноферментного, радиоиммунного анализа и других методов).

II. Агглютинационные тесты.

    Реакция агглютинации (РА) основана на взаимодействии поверхностных антигенов бактерий и других корпускулярных частиц с антителами и протекает в две фазы:

1. специфическая фаза – связывание детерминантной группы (эпитопа) антигена с паратопом – активным центром иммуноглобулина (невидимая фаза).

2. неспецифическая (видимая фаза) – образующийся комплекс (АГ+АТ) утрачивает растворимость и выпадает в осадок в виде хлопьев. Однако это явление возможно лишь в электролитной среде – 0,85% раствора натрия хлорида.

Реакцию агглютинации можно применять для обнаружения специфических антител в сыворотке крови или при помощи стандартной агглютинирующей сыворотки можно идентифицировать выделенные микроорганизмы.

    Развернутая реакция агглютинации для выявления специфических антител в сыворотке крови больного ставится в пробирках или лунках полистироловых планшетов. У больного (до приема пищи) берется кровь из вены в чистую пробирку, и выдерживается комнатной температуре около часа. Стеклянной палочкой образовавшийся сгусток крови отделяется от желтоватой жидкости – сыворотки, которую отсасывают в стерильную пробирку и хранят при температуре 4ºС до использования.

    Во все пробирки (7 штук) наливают по 0,5 мл физиологического раствора. В первую пробирку вносят 0,5 мл сыворотки – получается сыворотка разведением 1: 2. Отсюда 0,5 мл смеси переносят во вторую пробирку – получается сыворотка разведением 1: 4, и т.д. Из последней пробирки 0,5 мл смеси удаляют в дезинфицирующий раствор. Затем во все пробирки вносят по 1 капле диагностикума (взвесь убитых или живых бактерий), встряхивают и оставляют при комнатной температуре или инкубируют при 37ºС на 18 – 20 часов. Обязательные контроли – сыворотка без диагностикума и диагностикум без сыворотки.

    При положительном результате реакции на дне пробирки виден осадок в виде «перевернутого зонтика», а при отрицательном – осадок в виде «пуговицы».

    Ориентировочная реакция агглютинации служит для предварительного определения вида микроба. На стекло наносят каплю узкоспецифичной адсорбированной сыворотки (содержащей только специфические антитела). Сыворотку наносят в разведении 1: 100 и рядом – каплю физиологического раствора (контроль). Исследуемую культуру микроба петлей вносят в обе капли и размешивают. Через 2 - 4 минуты учитывают результат. При положительной реакции (соответствии исследуемой культуры диагностической сыворотке) наблюдается скучивание бактерий в виде хлопьев на фоне прозрачной жидкости. В контроле – равномерная муть. Реакцию ставят перед постановкой развернутой РА для идентификации микроба.

    Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) заключается в том, что молекулы антигена адсорбируются на поверхности эритроцитов. Такие «нагруженные» антигенами эритроциты приобретают способность агглютинироваться иммунной сывороткой, специфичной для данного антигена. Эритроциты склеиваются и выпадают в осадок, образуя на дне пробирки гемагглютинат в виде перевернутого зонтика.

    Реакция преципитации. В ней участвуют мелкодисперсные антигены (преципитиногены), которые связываются с соответствующими антителами (преципитинами). Чаще всего эту реакцию применяют для выявления антигенов по известной иммунной преципитирующей сыворотке, содержащей антитела – преципитины. Это качественный метод исследования. В узкую преципитационную пробирку добавляют стандартную иммунную сыворотку и на нее осторожно наслаивают жидкость, содержащую определяемый антиген. Появление на границе двух жидкостей кольца (преципитина) свидетельствует о наличии антигена (например, возбудителя сибирской язвы в реакции Асколи) в исследуемой жидкости. Преципитат возникает вследствие укрупнения коллоидных частиц антигена. Иногда эту реакцию называют кольцепреципитацией. Важным условием образования нерастворимого комплекса антиген – антитело является:

1. полная прозрачность жидкостей,

2. эквивалентное соотношение ингредиентов, так как образующийся комплекс растворяется в избытке антигена или антитела.

 

III. Вакцины и сыворотки.

Токсинообразование у микроорганизмов:

 

Выделяют экзотоксин	Образуют эндотоксин
Clostridium tetanus	Escherichia coli
Clostridium perfringens	Salmonella typhi abdominalis
Clostridium botulinus	Shigella flexneri
Clostridium diphtheriae	Neisseria meningitidis

 

    Среди препаратов различают:

1. вакцины и анатоксины – препараты вызывающие в организме специфический иммунный ответ с формированием активного противоинфекционного иммунитета за счет мобилизации механизмов иммунологической памяти;

2. иммунные сыворотки и иммуноглобулины – препараты, содержащие готовые специфические антитела (иммуноглобулины), введение которых в организм приводит к немедленному приобретению пассивного гуморального иммунитета, способного защитить организм от интоксикации или инфекции.

Иммунные сыворотки и иммуноглобулины.

Иммунные сыворотки и получаемые из них иммуноглобулины – биологические препараты, содержащие антитела. Они предназначены для создания пассивного антитоксического, антибактериального или антивирусного иммунитета у человека, нуждающегося в защите от инфекции или других потенциально – опасных веществ, обладающих антигенными свойствами.

 

Все сывороточные препараты делятся на две группы: гетерологичные, полученные из крови животных, и гомологичные, полученные из крови человека. Эти различия имеют принципиальное значение, так как гетерологичные препараты являются для организма человека чужеродными антигенами. Их применение сопровождается развитием антител, которые могут не только нейтрализовать действие препарата, но и вызвать в организме тяжелые аллергические и иммунокомплексные реакции.

Классификация вакцин

 

Группа вакцин по способам приготовления	Бактериальные вакцины	Вирусные вакцины
Живая (аттенуированная)	Туберкулезная – BCG Чумная Сибиреязвенная Туляремийная Бруцеллезная	Коревая Антирабическая Оспенная Паратитная Полиомиелитная I, II и III типов. Против желтой лихорадки.
Инактивированная	Лептоспирозная Коклюшная Гонококковая Бруцеллезная	Гриппозная Против клещевого энцефалита
Анатоксин	Стафилококковый Дифтерийный (АД) Столбнячный (АС) Секстаанатоксин Комбинированные препараты: дифтерийно - столбнячный (АДС), коклюшно – дифтерийно – столбнячный (АКДС)
Химическая (субъединичная)	Сыпно-тифозная Холерная (холероген + О-антиген) Менингококковая Брюшнотифозная	Гриппозная и др.
Рекомбинантная		Гриппозная и др.
Генно – инженерная		Против гепатита В

 

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НИЖЕГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ

«НИЖЕГОРОДСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ КОЛЛЕДЖ»

 

 

Лаборатория микробиологических методов исследования и техники лабораторных работ.

 

Методические рекомендации

для обучающихся по специальности 34.02.01 Сестринское дело

к проведению лабораторно – практических занятий

по дисциплине ОПД. 06 Основы микробиологии и иммунологии

 

Нижний Новгород

2017

 

Лабораторно – практическое занятие № 1

Протокол № 1

Тема: Освоение бактериологического метода исследования микроорганизмов.

Цель: Получить представление об устройстве и работе микробиологической лаборатории

Задачи:

1. Изучить правила техники безопасности
2. Приобрести знания о помещениях бактериологической лаборатории и их предназначении.
3. Приобрести навыки приготовления микробиологического мазка из жидкой культуры.
4. Приобрести навыки окрашивания по Граму.

 

Практическая часть:

Лабораторная работа № 1

«Правила техники безопасности при работе в бактериологической лаборатории»

Ход работы:

1. Ознакомиться с инструкциями №
2. Выписать в Протокол занятия основные положения Правил ТБ
3. Выучить правила техники инфекционной безопасности.

ПРАВИЛА ИНФЕКЦИОННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ

ПРИ РАБОТЕ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ.

1.    Не входить в лабораторию в верхней одежде (пальто, головном уборе) не вносить посторонние вещи.

2.    В бактериологической лаборатории запрещается принимать пищу, напитки, разговаривать по сотовому телефону.

3.    Приступать к занятиям, только надев хлопчатобумажный халат, шапочку и сменную обувь.

4.    Строго соблюдать правила обращения с химическими реактивами и красителями.

5.    С большой осторожностью пользоваться спиртами (огнеопасно!!!). 

6.    Помнить, что некоторые микроорганизмы, особенно споры грибов, являются аллергенами. Не допускать их распыления – не оставлять открытыми чашки Петри, пробирки, колбы с культурами микроорганизмов.

7.    Обязательно следить за порядком и чистотой в лаборатории и своим рабочим местом. После занятия обязательно протереть иммерсионный объектив микроскопа мягкой салфеткой, накрыть микроскоп чехлом, убрать в шкаф.

8.    Рабочее место, инструменты и лабораторную посуду вымыть и простерилизовать (по необходимости).

9.    Обязательно вымыть руки после работы в микробиологической лаборатории.

10.  Материал, поступающий в лабораторию для исследования всегда считать инфицированным / заразным. Исследуемый материал и отработанные культуры полежат уничтожению.

11.  При попадании исследуемого материала на поверхность лабораторной мебели, ее обрабатывают дезраствором, руки тщательно моют с мылом.

12.  Помнить, что студенты несут ответственность за используемые ими микроскопы, другое лабораторное оборудование, чистоту рабочего места.

13.  Перед уходом из лаборатории дежурный проводит влажную уборку помещения с дез.средством, проверяет, выключены ли вода, свет, электроприборы.

 

ПРАВИЛА ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ

ПРИ РАБОТЕ В БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

1     Перед работой убедитесь в исправности осветительных приборов и целостности проводки.

2     Работать с электроприборами разрешается сухими руками.

3     Переставлять и переносить осветительные приборы, микроскопы во включенном состоянии недопустимо.

4     Перед работой проверьте плотность прилегания штуцера к корпусу спиртовки.

5     Зажигайте спиртовку спичкой. Гасите, накрывая пламя колпачком. Не передвигайте горящую спиртовку.

 

Лабораторная работа № 2

«Устройство микробиологической лаборатории»

Медицинская бактериологическая лаборатория является одним из основных подразделений больниц, санитарно – эпидемиологических станций, научно - исследовательских институтов. Исследования в лаборатории проводятся как с диагностической, так и с научной целью. В бактериологической лаборатории выделяют «чистую» и «заразную» зоны.

В чистой зоне расположены помещения, где отсутствует контакт с биологическим материалом: гардероб, санпропускник, комната приема пищи, ординаторская, складские помещения (материальные: полотенца, вата, среды и т.д.).

       Заразная зона баклаборатории имеет ряд помещений:

1     Лабораторная комната служит для проведения бактериологических исследований.

2     Средоварня служит для приготовления и разливания питательных сред.

3     Моечная – для обработки и подготовки посуды для стерилизации.

4     Автоклавная – стерилизационная комната.

5     Бокс служит для проведения работ в асептических условиях.

6     Комната регистрации и приема материала – для анализа.

В каждой комнате должны быть раковины, стены покрыты кафелем, пол – линолеумом. Для выращивания микробов необходимы особые приборы – термостаты. Для стерилизации необходимы автоклавы и сушильные шкафы.

Оборудование рабочего стола лаборанта/санитарного фельдшера.

1     Спиртовка

2     Бактериологические петли, иглы, шпатели

3     Предметные и покровные стекла

4     Вата или марлевые салфетки

5     Мыло

6     Карандаши по стеклу

7     Спички

8     Пипетки

9     Наборы красителей: генцианвиолет, водный раствор фуксина,     раствор Люголя, Спирт 95º.

10   Колба для воды

11   Стакан или банка с дезинфицирующим раствором

12   Банка для мусора

13   Пинцеты

14   Иммерсионное масло

15   Микроскоп

16   Микробиологический мостик

17   Кристаллизатор (простоквашница)

Практическое задание:

Собрать рабочий стол лаборанта/санитарного фельдшера.

 

Лабораторная работа № 3

«Приготовление микробиологического мазка из жидкой культуры»

       На исследование мазок можно брать как из жидкой, так и из плотной культуры. Если мы работаем с плотной питательной средой, то мазок эмульгируется в капле воды. Жидкая питательная среда не требует дополнительного разведения.

Ход работы:

1. чистые сухие предметные стекла обезжирить, натерев их кусочком мыла, а затем протерев марлевой салфеткой.
2. на обезжиренное стекло нанести пипеткой каплю воды (для плотной культуры).
3. профламбировать микробиологическую петлю в пламени спиртовки (кольцо, проволочную ножку до держателя).
4. охладить петлю о стенку пробирки или крышку чашки Петри.
5. захватить петлей часть культуры
6. опустить петлю с культурой на стекло в каплю воды и тщательно растереть (эмульгировать) до гомогенного тонкого ровного слоя.
7. профламбировать петлю, сжечь остатки культуры.
8. мазок высушить на воздухе.
9. высушенный мазок зафиксировать над пламенем спиртовки (3 – 5 сек) трижды медленно проводя через пламя. На этом этапе мазок закрепляется на стекле, микробы инактивируются, убитые микроорганизмы лучше воспринимают краску.

 

Окрашивание по Граму.

       Традиционный метод окрашивания микроорганизмов, предложенный Грамом.

1. на фиксированный мазок нанести 1 – 2 капли генцианвиолета на 3 – 5 мин.
2. промыть водой, держа препарат ребром.
3. нанести раствор Люголя на 1 – 2 мин.
4. дифференцировать в этиловом спирте до почернения препарата и отхождения облачков краски 30 – 60 сек.
5. промыть водой.
6. докрасить водный раствором фуксина 30 – 60 сек.
7. тщательно промыть водой, высушить, микроскопировать с иммерсией.

       Результат окрашивания: гр+ - сине – фиолетовые, гр- красные.

 

ЗАПОМНИТЬ:

Грам-положительные микроорганизмы	Грам-отрицательные микроорганизмы
Стафилококки	Менингококки (бобовидные)
Стрептококки	Гонококки (бобовидные, в оболочке лейкоцитарной)
Пневмококки (пламя свечи)	Эшерихии (кишечная палочка)
Палочки сибирской язвы	Сальмонеллы
Палочки дифтерии	Шигеллы (дизентерия)
Палочка Коха (туберкулеза)	Холерный вибрион
Клостридии столбняка	Палочка чумы
Клостридии ботулизма	Возбудитель бруцеллеза
Клостридии (перфрингенс) газовой гангрены	Возбудитель коклюша

 

Приложение 1

 

Вопросы для контроля опорных знаний по теме:

 

1) Какие формы микроорганизмов вам известны

2) Строение бактериальной клетки

3) Строение клеточной оболочки

4) Тинкториальные свойства микроорганизмов

5) Периоды роста микроорганизмов

Приложение №2