Бактериальные токсины. Их природа, механизмы действия, возможности конструирования гибридных и модифицированных токсинов

Бактериальные токсины. Их природа, механизмы действия, возможности конструирования гибридных и модифицированных токсинов

Супотницкий М.В.
ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития России, [email protected]

Организация бактериальных токсинов характерна для сигнальных молекул, способных действовать на большом расстоянии от источника без ослабления силы сигнала. Их эволюция происходила путем нарастания сложности молекул, вызванной дупликациями и слияниями генов, кодирующих отдельные домены. Древность происхождения бактериальных токсинов ставит под сомнение не только антропонозный характер многих инфекционных болезней, в развитии которых токсины определяют основные симптомы, но и существующие представления о поддержании в природе их возбудителей. По механизму действия токсины могут быть разделены на 5 групп: повреждающие мембраны, ингибиторы белкового синтеза, активаторы иммунного ответа, протеазы, активаторы вторичных мессенджеров. Общая для всех бактериальных токсинов структура, в которой одна из субъединиц играет роль лиганда, другая вызывает токсический эффект, позволяет вести исследования, направленные на получение нового поколения медицинских иммунобиологических препаратов, не имеющих аналогов в природе. В настоящее время разработаны подходы для вмешательства в структуру молекул токсинов, позволяющие получать иммунотоксины для прицельного терапевтического воздействия на злокачественные клетки крови, и токсины с измененной специфичностью и/или с более высокой токсичностью в отношении отдельных видов насекомых. Максимально возможная токсичность для природных, гибридных и модифицированных токсинов ограничена невозможностью дальнейшего усложнения их молекулярной структуры и не будет превышать токсичности ботулинического токсина.

Organization of bacterial toxins is specific for signaling molecules, that are able to act far from the source without loosing the signal intensity. They evolved by growing molecular complexity, caused by duplication and fusion of genes encoding separate domains. Antiquity of the origin of bacterial toxins not only puts in doubt anthroponosis type of many infectious diseases, in the progress of which the symptoms are defined by toxins, but also existing perceptions about sustention of their pathogenic agents in nature. Toxins can be divided into 5 groups according to their mode of action: damage membranes, inhibit protein synthesis, activate immune response, protease, activate second messenger pathways. The structure is common for all bacterial toxins: one of the subunits acts as a ligand, the other causes toxic effect. This allows to perform studies, aimed at obtaining new generation of immunobiological medicines, that don’t have analogues in nature. At present there have been developed approaches for intervention into the structure of toxin’s molecules, which allow to obtain immunotoxins for targeted therapeutic action at cancerous blood cells and toxins with modified specificity and/or with higher toxicity with respect to individual insect species. Maximum potential toxicity for native, hybrid and modified toxins is limited because of the impossibility of further amplification of their molecular structure and does not exceed botulinum toxin’s toxicity.

Токсинами после открытия Эмилем Ру и Александром Иерсиным в 1888 г. дифтерийного токсина традиционно называют белковые вещества, образуемые преимущественно микроорганизмами и некоторыми животными, и обладающие ядовитым действием. Токсины определяют основные симптомы дифтерии, коклюша, холеры, сибирской язвы, ботулизма, столбняка, гемолитического уремического синдром и некоторых других инфекционных болезней человека и животных. К настоящему времени накоплены данные, показывающие возможность выполнения токсинами функций, не имеющих отношения к инфекционным процессам. Среди них: использование бактериями токсинов как средства антагонизма в микробных сообществах (холерный токсин оказывает ингибирующее действие на ряд бактерий); участие токсинов в авторегуляторных процессах в бактериальных популяциях (энтеротоксин C. perfringens) и др. [5].

Достижения генной и белковой инженерии открыли ученым возможности по конструированию новых медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) на основе производных бактериальных токсинов, не имеющих аналогов в природе. Целью работы является обобщение данных по природе, механизмам действия и возможностям конструирования гибридных и модифицированных токсинов бактерий.

Порообразующие токсины

К ним относят бактериальные токсины, которые формируют посредством вставки в плазматическую мембрану хозяина функционирующие трансмембранные поры (каналы), приводящие клетку к лизису. Такие токсины еще называют RTX-семейством (repeats in toxin) из-за наличия в их молекулах большого количества повторов [18]. Механизм их действия хорошо прослеживается на примере альфа-токсина S. aureus, рассматриваемого как прототип олигомеризующегося пороформирующего цитотоксина [36]. Альфа-токсин синтезируется как прекурсорная молекула из 319 аминокислот, содержащая N-концевую последовательность из 26 аминокислот. Секретируемый бактерией «зрелый» токсин (протомер), является гидрофильной молекулой с массой 33 кДа, утратившей цистеиновые остатки [12]. Протомер «узнает» клетку-мишень по высокоаффинным рецепторам или неспецифически сорбируется в участках плазматической мембраны, содержащих фосфатидилхолин или холестерин. На мембране семь протомерных токсинов собираются в пору, формируя грибоподобный гептамер (232 кДа), включающий три различных домена [38]. Шляпка и ободочная область гептамера альфа-токсина располагаются на поверхности плазматической мембраны, в то время как ножка служит трансмембранным каналом. Образовавшаяся пора позволяет маленьким молекулам и ионам двухстороннее движение, что, в конечном итоге, приводит клетку к вздутию и гибели от осмотического шока [36]. Альфа-токсин действует цитолитически в отношении различных типов клеток (рис. 4).

Рис. 4. Действие альфа-токсина S. aureus на эритроциты кролика и искусственные липидные мембраны. А. Фрагмент эритроцита кролика, лизированный альфа-токсином S. aureus. На поверхности мембраны наблюдаются многочисленные кольцеобразные структуры размером 10 нм (показаны стрелками). Б. Изолированные гексамеры токсина в растворе детергента. В. Лектиновые липосомы, включающие реинкорпорированные гексамеры токсина (последние выглядят как штырьки вдоль краев липосомной мембраны — показаны стрелками). Липосома, избежавшая включения молекул альфа-токсина, показана звездочкой. Черные полосы соответствуют 100 мкм. По [12].

Альфа-токсин S. aureus способен лизировать моноциты, лимфоциты, эритроциты, тромбоциты, и эндотелиальные клетки человека [11], но его роль в развитии стафилококковых инфекций неизвестна.

К другим членам RTX-семейства относят гемолизин E. coli (HlyA), аденилатциклазу В. pertussis, лейкотоксин Pasterella haemolitica. Это семейство токсинов является также частью консервативного механизма секреции I типа, отвечающего за их транспорт из бактериальной клетки. Образование поры включает каскад вторичных реакций, приводящих к другим патологическим последствиям. Среди них активация эндонуклеаз, высвобождение цитокинов и медиаторов воспаления, синтез эйкозаноидов и др. [11].

Способность формировать белковые каналы в клеточной мембране не является уникальным свойством бактериальных токсинов. Посредством поры осуществляется транспорт специфических ионов через мембраны эукариотических и прокариотических организмов. К образованию пор способны белки слияния вирусов. Аналогичным образом «действуют» цитолитические белки ядов животных [5, 6].

Протеолитические токсины

Ботулинический (в России ботулинический нейротоксин типа A зарегистрирован под торговыми наименованиями «Диспорт» и «Ботокс». Препараты ботулинического токсина применяются для временного сглаживания межбровных морщин, лечения косоглазия, блефароспазма и блокирования повышенного потоотделения) и столбнячный токсины (оба цинкметаллоэндопротеазы) в опытах на животных показывают наименьшую из известных LD₅₀. Удивительно, насколько различную клиническую картину дают поражения этими токсинами, имеющими столь значительное сходство в структуре, энзиматической активности и мишенях среди клеток нервной системы, но различающиеся путями проникновения в макроорганизм. Например, ботулинический токсин проникает в организм энтерально и вызывает вялые параличи периферических нервов. Столбнячный же токсин, образуясь на поверхностях ран, колонизированных C. tetani, приводит к спастическим параличам через поражение ЦНС [18].

Эти самые смертельные для человека токсины имеют и наиболее сложные молекулы среди известных токсических молекул. Оба синтезируются в виде неактивных полипептидов массой 150 кДа (прототоксины) и высвобождаются из лизировавшихся клеток. Затем прототоксины активируются посредством протеолитического расщепления открытой петли в структуре своей молекулы. Каждая активная молекула нейротоксина включает тяжелую (100 кДа) и легкую (50 кДа) цепи, связанные посредством межцепочечной дисульфидной связи. Тяжелые цепи обоих токсинов содержат два домена — регион, необходимый для транслокации токсина (N-концевая последовательность) и регион, необходимый для связывания с клеткой (С-концевая последовательность). Легкие цепи обоих токсинов содержат цинк-связывающий мотив, необходимый для цинк-зависимой протеазы, активирующей молекулу [34].

Ботулинические токсины связываются с рецепторами на поверхности пресинаптической мембраны двигательных нейронов периферической нервной системы и вызывают протеолиз белков в нейронах. Это приводит к ингибированию высвобождения ацетилхолина и к предотвращению мышечных сокращений — возникает вялый паралич [19]. Столбнячный токсин сначала связывается с рецепторами на пресинаптической мембране моторных нейронов, но затем, с помощью ретроградного везикулярного транспорта, он перемещается в нейроны спинного мозга. Спастический паралич возникает из-за того, что рассечение везикуло-ассоциированных белков и синаптобревина в нейронах нарушает высвобождение глицина и гамма -амино-битуриковой кислоты, прекращающих мышечное сокращение [9].

Активаторы иммунного ответа

Отдельные бактериальные токсины могут действовать непосредственно на Т-клетки и антигенпрезентирующие клетки иммунной системы. Самое большое семейство токсинов данного типа называют пирогенными токсинами-суперантигенами (PTSAg). Это стабильные, секретируемые токсины с ММ в пределах от 22 до 30 кДа. К ним относятся стафилококковые энтеротоксины серотипов A-E, G и H; пирогенные экзотоксины стрептококков группы A серотипов A-C и F; стафилококковый TSST-1. Как правило, иммуностимулирующий потенциал таких токсинов является следствием их способности связывать различные участки белков главного комплекса гистосовместимости II типа, экспрессированных на поверхности антигенпрезентирующих клеток и Vбета-элементы на Т-клеточном рецепторе [36]. В частности, В-домен стафилококкового TSST-1 связывает альфа-цепь антигена DR1 человеческого лейкоцита.

Одновременно его А-домен специфически связывается с Vбета-элементами Т-клеточного рецептора. Связывание TSST-1 с Vбета 2 приводит к массивной пролиферации более 20% периферических Т-клеток. Следствием Т-клеточной экспансии является массивное высвобождение интерлейкинов (1, 2 и 6 типов), гамма-интерферона, факторов некроза опухолей (альфа и бета) и др. [35]. Совместно эти цитокины вызывают гипотензию, высокую температуру и диффузные эритематозные высыпания [36].

Иммунотоксины

Как частный случай гибридного токсина могут рассматриваться иммунотоксины — химерные белки, включающие два домена, один из которых обладает свойствами антитела, а другой свойствами ферментативной субъединицы токсина. Первый домен обеспечивает связывание химерного белка со специфической молекулой или клеткой, второй инактивирует молекулу-мишень или убивает клетку.

Иммунотоксины — первое поколение МИБП, полученных на основе производных бактериальных токсинов, не имеющих аналогов в природе. Появление иммунотоксинов вызвано трудностями прицельного терапевтического воздействия на злокачественно переродившиеся клетки крови. Первым таким средством были немеченые мАт, индуцировавшие апоптоз клеток-мишеней после взаимодействия с их рецепторами или вызывавшие их гибель по другим механизмам (rituximab и alemtuzumab). Однако в процессе клинических испытаний выяснилось, что более чем у половины пациентов раковые клетки устойчивы к действию мАт. Тогда их стали конъюгировать с радионуклидами. Эти агенты оказались эффективными для лечения пациентов со злокачественными новообразованиями, резистентными к мАт, но не могли использоваться широко из-за их дозозависимой токсичности для клеток костного мозга. Третий тип препаратов для прицельного терапевтического воздействия на злокачественные клетки представлял собой мАт с конъюгированными химиопрепаратами. Они оказались более эффективными и вызывали меньшее количество неспецифических осложнений при лечении острой миелоидной лейкемии (acute myelogenous leukemia, AML), чем мАт, конъюгированные с радионуклеотидами. Но и к ним были обнаружены резистентные опухолевые клетки, что потребовало дальнейшего совершенствование препаратов, действующих через специфическое узнавание рецепторов на поверхности опухолевых клеток [21].

Рис. 7. 3D-модели токсинов семейства Cry с модифицируемыми участками. А. Токсин Cry1A. Стрелками показаны точечные мутации в доменах I и II. Делетированный N-концевой регион обозначен черным цветом (Cry1AMod-токсин). Мутации N372A или N372G, локализованные в петле 2 домена II, ведут к восьмикратному увеличению токсичности по отношению к Lymantria dispar. Тройной мутант — N372A, A282G и L283S — показывает 36-кратное увеличение токсичности. Б. Токсин Cry3A. Стрелками показаны точечные мутации в домене II, улучшающие его инсектицидную активность. Созданный протеолитический сайт, включенный в домен I, показан черным цветом. В. Токсин Cry2A. Черным цветом показан N-концевой регион токсина, делетированный для улучшения его инсектицидной активности. По [31].

Способность иммунотоксинов к прицельному уничтожению раковых клеток начинается с одной молекулы ферментативной субъединицы токсина, доставленной к поверхности клетки-мишени специфическим антителом. Поэтому иммунотоксины представляют собой некий предел в развития таких средств терапии злокачественных опухолей крови. В качестве ферментативной молекулы при конструировании иммунотоксинов используют ферментативные субъединицы (домены) токсинов, блокирующие белковый синтез в клетках. Среди растительных токсинов наиболее часто используются рицин и абрин; среди бактериальных — одноцепочечные токсины: дифтерийный и экзотоксин псевдомонад.

Разработчики иммунотоксинов учитывают то обстоятельство, что обе субъединицы токсина содержат большое количество карбоксильных групп, связывающих их с неизмененными тканями, и, в частности, с тканями печени и почек. Поэтому прежде чем конъюгировать их с антителом, субъединицы дегликозилируют различными способами (получая рекомбинантные формы токсина в кишечной палочке, химическим путем и др.).

Оптимальным объектом для лечения иммунотоксинами являются опухолевые заболевания системы крови. Злокачественные клетки расположены внутри сосудов и доступны для препарата при внутривенном введении. К тому же иммунная система таких пациентов часто утрачивает способность к эффективному антительному ответу на сам иммунотоксин. Конструирование иммунотоксинов, используемых в медицинских целях, предполагает повышение их специфичности именно к опухолевым клеткам и как можно большую их безопасность для клеток нормальных тканей. В клинике токсичность таких препаратов оценивают по так называемой максимальной переносимой дозе (maximum tolerated dose, MTD). Признаки ее превышения неспецифические: астения, подъем уровня печеночных трансаминаз в крови, гипотензия. При появлении таких симптомов дозу препарата снижают. При более высокой дозе иммунотоксина у пациента может развиться синдром пропускания сосудов (vascular leak syndrome, VLS; Clarkson syndrome), вызванный высвобождением цитокинов после гибели периваскулярных Т-клеток. Основные симптомы: гипотензия, гипоальбуминемия без альбуминурии, генерализованный отек, низкий гематокрит. Количества иммунотоксинов, вызывающих осложнения, находятся в пределах десятков мкг на кг веса пациента [21].

Рис. 8. График токсоиды по Н.С. Антонову. Максимальная токсичность «супертоксинов» достигается за счет предельного увеличения размеров и сложности их молекул.

Заключение

Структура, механизмы действия и древность происхождения бактериальных токсинов свидельствуют о том, что их эволюция началась еще в сообществах одноклеточных микроорганизмов, где они играли роль сигнальных молекул, способных действовать на большом расстоянии от бактериальной клетки без ослабления силы сигнала. Эволюция токсинов происходила путем нарастания сложности их молекул, вызванной дупликациями и слияниями генов, кодирующих белки их отдельных доменов. Древность бактериальных токсинов позволяет поставить под сомнение антропозность отдельных инфекционных болезней, например, холеры, коклюша и дифтерии. Видимо целесообразно вести поиск природных резервуаров возбудителей этих болезней в сообществах простейших организмов. Субъединичная структура токсинов, где одна из субъединиц играет роль лиганда, другая вызывает токсический эффект, позволяет осуществлять исследования, направленные на получение нового поколения медицинских иммунобиологических препаратов, не имеющих аналогов в природе. В настоящее время разработаны подходы для вмешательства в структуру молекул токсинов, позволяющие получать иммунотоксины для прицельного терапевтического воздействия на злокачественные клетки крови, и токсины с измененной специфичностью и/или с более высокой токсичностью в отношении отдельных видов насекомых. Токсичность ботулинического токсина предельна не только для бактериальных токсинов, но и для природных токсических веществ. При модификации токсинов наиболее вероятно изменение спектра их целей. LD₅₀ гибридных и модифицированных токсинов даже при повышении их токсичности для отдельных экспериментальных животных, будет находиться в пределах, характерных для токсических веществ данного диапазона молекулярных масс.

Литература:

1. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки: В 3 т. // Пер. с англ. под ред. Г.П. Георгиева и Ю.С. Ченцова. — М., 1994.
2. Антонов Н.С. Химическое оружие на рубеже двух столетий. — М., 1994.
3. Вертиев Ю.В. Бактериальные токсины: биологическая сущность и происхождение // Журн. микробиол. — 1996. — № 3. — С. 43–46.
4. Езепчук Ю.В. Патогенность, как функция биомолекул. — М., 1985.
5. Супотницкий М.В. Микроорганизмы, токсины и эпидемии. — М., 2005.
6. Филдс Б., Найп Д., Ченок Р. и др. Вирусология: В 3 т. // Пер. с англ. под ред. Н.В. Каверина, Л.Л. Киселева. — М., 1989.
7. Шувалова Е.П. и др. Инфекционные болезни. — Ростов на Дону, 2001.
8. Aktories K. Rho proteins: targets for bacterial toxins // Trends Microbiol. — 1997. — Vol. 5, № 2. — P. 282–288.
9. Arnon S. Human tetanus and human botulism // The clostridia: molecular biology and pathogenesis / Ed. Rood J.I., McClane B.A., Songer J.G., Titball R.W. San Diego: Academic Press; 1997. — P. 95–115.
10. Barth H., Aktories K., Popoff M.R. et al. Binary bacterial toxins: biochemistry, biology, and applications of common Clostridium and Bacillus proteins // Microbiol. Mol. Biol. Rev. — 2004. — Vol. 68, № 3. — P. 373–402.
11. Bhakdi S., Bayley H., Valeva A. et al. Staphylococcal alpha-toxin, streptolysin-O and Escherichia coli hemolysin: prototypes of pore-forming bacterial cytolysins // Arch. Microbiol. — 1996. — Vol. 165, № 1. — P. 73–79.
12. Bhakdi S., Tranum-Jensen J. Alpha-toxin of Staphylococcus aureus // Microbiol. Rev. — 1991. — Vol. 55, № 4. — P. 733–751.
13. Blum G., Falbo V., Caprioli A. et al. Gene clusters encoding the cytotoxic necrotizing factor type 1, Prs-fimbriae and -hemolysin form the pathogenicity island II of the uropathogenic Escherichia coli strain J96 // FEMS Microbiol. Lett. — 1995. — Vol. 126, № 1. — P. 189–196.
14. Bravo A., G mez I., Conde J. et al. Oligomerization triggers binding of a Bacillus thuringiensis Cry1Ab pore-forming toxin to aminopeptidase N receptor leading to insertion into membrane microdomains // Biochim. Biophys. Acta. — 2004. — Vol. 1667. — P. 38–46.
15. Caramori T., Albertini A.M., Galizzi A. In vivo generation of hybrids between two Bacillus thuringiensis insect-toxin-encoding genes // Gene. — 1991. — Vol. 98. — P. 37–44.
16. De Maagd R.A., Bravo A., Creckmore N. How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world // Trends in Genet. — 2001. — Vol. 17. — P. 193–199.
17. De Maagd R.A., Kwa M.S.G., Van der Klei H. et al. Domain III substitution in Bacillus thuringiensis delta-endotoxin Cry1Ab results in superior toxicity for Spodoptera exigua and altered membrane protein recognition // Appl. Environ. Microbiol. — 1996. — Vol. 62. — P. 1537–1543.
18. Finlay B., Falkow S. Common themes in microbial pathogenicity // Microbiol. Rev. — 1997. — Vol. 53, № 2. — P. 210–230.
19. Halpern J., Neale E. Neurospecific binding, internalization and retrograde axonal transport // Curr. Top. Microbiol. Immunol. — 1995. — Vol. 195, № 1. — P. 221–241.
20. Henkel J.S., Baldwin M.R., Barbieri J.T. Toxins from bacteria // EXS. — 2010. — № 100. — P. 1–29.
21. Kreitman R.J. Immunotoxins for targeted cancer therapy // The AAPS Journal (http://www.aapsj.org). — 2006. — Vol. 8, № 3. — E532–E551.
22. Kreitman R.J. Recombinant immunotoxins containing truncated bacterial toxins for the treatment of hematologic malignancies // BioDrugs. — 2009. — Vol. 23, № 1. — P. 1–13.
23. Lacy D.B., Lin H., Melnyk R.A. et al. A model of anthrax toxin lethal factor bound to protective antigen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2005. — Vol. 102. — P. 16409–16414.
24. Lemichez E., Flatau G., Bruzzone M. et al. Molecular localization of the Escherichia coli cytotoxic necrotizing factor CNF1 cell-binding and catalytic domains // Mol. Microbiol. — 1997. — Vol. 24, № 7. — P. 1061–1070.
25. Lemichez E., Flatau G., Bruzzone M. et al. Molecular localization of the Escherichia coli cytotoxic necrotizing factor CNF1 cell-binding and catalytic domains // Mol. Microbiol. — 1997. — Vol. 24, № 7. — P. 1061–1070.
26. Liu X. S., Dean D.H. Redesigning Bacillus thuringiensis Cry1Aa toxin into a mosquito toxin // Prot. Eng. Design. Selec. — 2006. — Vol. 19. — P. 107–111.
27. Lobet Y., Cieplak W., Smith S.G. et al. Effects of mutations on enzyme activity and immunoreactivity of the S1 subunit of pertussis toxin // Infec. Immun. — 1989. — Vol.57, №11. — P. 3660–1668.
28. Loosmore S., Zealy G.R., Boux H.A. et al. Engineering of genetically detoxified pertussis toxin analogs for development of a recombinant whooping cough vaccine // Infec. Immun. — 1990. — Vol. 58, № 5. — P. 3653–3662.
29. Mandal C.C., Gayen S., Basu A. et al. Prediction based protein engineering of domain I of Cry2A entomocidal toxin of Bacillus thuringiensis for the enhancement of toxicity against lepidopteran insects// Prot. Eng. Design. Selec. — 2007. — Vol. 20. — P. 599–606.
30. Pardo-L pez L., Gomes I., Rausell C. et al. Structural changed of of the eCry1Ac oligomeric pre-pore from Bacillus thuringiensis induced by N-acetygalactosamine facilitates toxin membrane insertion // Biochem. — 2006. — Vol. 45. — P. 10329–10336.
31. Pardo-L pez L., Mu oz-Garay C., Porta H. Strategies to improve the insecticidal activity of Cry toxins from Bacillus thuringiensis // Peptides. — 2009. — Vol. 30, № 3. — P. 589–595.
32. Petosa C., Collier P., Klimpel K. R. et al. Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen // Nature. — 1997. — Vol. 385, № 6619. — P. 833–838.
33. Rajamohan F., Alzate O., Cotrill J.A. et al. Protein engineering of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin: mutations at domain II of CryIAb enhance receptor affinity and toxicity toward gypsy moth larvae// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. —1996. — Vol. 93. — P. 14338–14343. Schiavo G., Montecucco C. The structure and mode of action of botulinum and tetanus toxins // The clostridia: molecular biology and pathogenesis / Ed. Rood J., McClane B., Songer J., Titball R. San Diego: Academic Press; 1997. — P. 295–322.
34. Schlievert P. Searching for superantigens // Immunol. Infec. — 1997. — Vol. 26, № 2. — P. 283–290.
35. Schmitt C.K., Meysick K.C., Brien A.D. Bacterial toxins: friends or foes? // Emerg. Infect. Dis. — 1999. — Vol. 5, № 2. — P. 224–234.
36. Schnepf E., Crickmore N., Van Rie J. et al. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins // Microbiol. Mol. Biol. Rev. — 1998. — Vol. 62. — P. 705–806.
37. Song L., Hobaugh M., Shustak C. et al. Structure of staphylococcal alpha-hemolysin, a heptameric transmembrane pore // Science. — 1996. — Vol. 274, № 14. — P. 1859–1866.
38. Walters F.S., Stacy Ch.M., Lee M.K. et al. An engineered chymotrypsin/cathepsin G site in domain I renders Bacillus thuringiensis Cry3A active against western corn rootworm larvae // Appl. Environ. Microbiol. — 2008. — Vol. 74. — P. 367–374.
39. Wirth M.C., Georghiou G.P., Federici B.A. CytA enables CryIV endotoxins of Bacillus thuringiensis to overcome high levels of CryIV resistance in the mosquito Culex quinquefasciatus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1997. — Vol. 94. — P. 10536–10540.
40. Wu D., Aronson A.I. Localized mutagenesis defines regions of the Bacillus thuringiensis deltaendotoxin involved in toxicity and specificity // J. Biol. Chem. — 1992. — Vol. 267. — P. 2311–2327.

 

Бактериальные токсины. Их природа, механизмы действия, возможности конструирования гибридных и модифицированных токсинов

Супотницкий М.В.
ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития России, [email protected]

Организация бактериальных токсинов характерна для сигнальных молекул, способных действовать на большом расстоянии от источника без ослабления силы сигнала. Их эволюция происходила путем нарастания сложности молекул, вызванной дупликациями и слияниями генов, кодирующих отдельные домены. Древность происхождения бактериальных токсинов ставит под сомнение не только антропонозный характер многих инфекционных болезней, в развитии которых токсины определяют основные симптомы, но и существующие представления о поддержании в природе их возбудителей. По механизму действия токсины могут быть разделены на 5 групп: повреждающие мембраны, ингибиторы белкового синтеза, активаторы иммунного ответа, протеазы, активаторы вторичных мессенджеров. Общая для всех бактериальных токсинов структура, в которой одна из субъединиц играет роль лиганда, другая вызывает токсический эффект, позволяет вести исследования, направленные на получение нового поколения медицинских иммунобиологических препаратов, не имеющих аналогов в природе. В настоящее время разработаны подходы для вмешательства в структуру молекул токсинов, позволяющие получать иммунотоксины для прицельного терапевтического воздействия на злокачественные клетки крови, и токсины с измененной специфичностью и/или с более высокой токсичностью в отношении отдельных видов насекомых. Максимально возможная токсичность для природных, гибридных и модифицированных токсинов ограничена невозможностью дальнейшего усложнения их молекулярной структуры и не будет превышать токсичности ботулинического токсина.

Organization of bacterial toxins is specific for signaling molecules, that are able to act far from the source without loosing the signal intensity. They evolved by growing molecular complexity, caused by duplication and fusion of genes encoding separate domains. Antiquity of the origin of bacterial toxins not only puts in doubt anthroponosis type of many infectious diseases, in the progress of which the symptoms are defined by toxins, but also existing perceptions about sustention of their pathogenic agents in nature. Toxins can be divided into 5 groups according to their mode of action: damage membranes, inhibit protein synthesis, activate immune response, protease, activate second messenger pathways. The structure is common for all bacterial toxins: one of the subunits acts as a ligand, the other causes toxic effect. This allows to perform studies, aimed at obtaining new generation of immunobiological medicines, that don’t have analogues in nature. At present there have been developed approaches for intervention into the structure of toxin’s molecules, which allow to obtain immunotoxins for targeted therapeutic action at cancerous blood cells and toxins with modified specificity and/or with higher toxicity with respect to individual insect species. Maximum potential toxicity for native, hybrid and modified toxins is limited because of the impossibility of further amplification of their molecular structure and does not exceed botulinum toxin’s toxicity.

Токсинами после открытия Эмилем Ру и Александром Иерсиным в 1888 г. дифтерийного токсина традиционно называют белковые вещества, образуемые преимущественно микроорганизмами и некоторыми животными, и обладающие ядовитым действием. Токсины определяют основные симптомы дифтерии, коклюша, холеры, сибирской язвы, ботулизма, столбняка, гемолитического уремического синдром и некоторых других инфекционных болезней человека и животных. К настоящему времени накоплены данные, показывающие возможность выполнения токсинами функций, не имеющих отношения к инфекционным процессам. Среди них: использование бактериями токсинов как средства антагонизма в микробных сообществах (холерный токсин оказывает ингибирующее действие на ряд бактерий); участие токсинов в авторегуляторных процессах в бактериальных популяциях (энтеротоксин C. perfringens) и др. [5].

Достижения генной и белковой инженерии открыли ученым возможности по конструированию новых медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) на основе производных бактериальных токсинов, не имеющих аналогов в природе. Целью работы является обобщение данных по природе, механизмам действия и возможностям конструирования гибридных и модифицированных токсинов бактерий.