Окисление аммиака до нитрит-аниона

Первая стадия — окисление аммиака до нитрит-аниона, которое осуществляют нитрозные бактерии родов Nitrosomonas, Nitrosococcus и Nitrosospira (ранее выделялись также рода Nitrosolobus, Nitrosovibrio, но сейчас их представители включены в Nitrosospira) по следующему механизму:

1. NH₃ + O₂ + НАДН₂ → NH₂OH + H₂O + НАД⁺

2. NH₂OH + H₂O → HNO₂ + 4H⁺ + 4e⁻

3. 1/2O₂ + 2H⁺ + 2e⁻ → H₂O

Предполагается, что на первом этапе субстратом является именно аммиак, а не аммоний, поэтому процесс не идёт в кислой среде. Ферментом для первой реакции служит аммиакмонооксигеназа, фермент с очень низкой субстратной специфичностью, окисляющая также метан, оксид углерода, циклогексан, фенол, бензиловый спирт, однако со скоростью на порядки ниже. Гидроксиламин ингибирует работу фермента. В бесклеточных экстрактах восстановителем может служить НАД(Ф)·H, однако в клетке его роль, скорее всего, выполняет один из компонентов дыхательной цепи.

Следующую реакцию осуществляет гидроксиламиноксидоредуктаза, расположенная в периплазме. Окислителем в них служит цитохром c, с него электрон передаётся на убихинон и далее в дыхательную цепь, на цитохромоксидоредуктазу и, в конечном итоге, на кислород. При этом запасается энергия в виде трансмембранного протонного потенциала.

Образование НАД(Ф)·H для фиксации углекислого газа в цикле Калвина происходит путём обратного переноса части электронов.

Окисление нитрит-аниона до нитрат-аниона[править | править код]

Вторая стадия — окисление аниона азотистой кислоты до аниона азотной, производимое нитратными бактериями (почвенный род Nitrobacter и водные Nitrospira, Nitrococcus, Nitrospina). Процесс протекает в одну реакцию:

NO₂⁻ + H₂O → NO₃⁻ + 2H⁺ + 2e⁻

катализируемую нитрит: нитрат-оксидоредуктазой, локализованной в ЦПМ. Далее электроны передаются на цитохромы дыхательной цепи, в которой единственным пунктом транслокации протонов является цитохромоксидаза.

Образование НАД(Ф)·H для фиксации углекислого газа также происходит путём обратного переноса электронов.

Организмы[править | править код]

Нитрозных и нитритных бактерий ранее выделяли в семейство Nitrobacteraceae, сейчас с развитием геносистематики их рода разнесены по разным подклассам протеобактерий. Оптимальная для их развития температура 25—30 °C и pH 7,5—8,0. В кислой среде процесс не идет. Все эти бактерии — грамотрицательные хемолитоавтотрофы, использующие энергию окисления соединений азота для синтеза органических веществ из углекислого газа. Некоторые из них способные переключаться на хемоорганогетеротрофный метаболизм, однако ни одного хемолитогетеротрофа среди данных организмов найдено не было. Морфологически эти группы разнообразны, в большинстве своем мелкие, подвижные, с полярным или перитрихиальным жгутикованием. Окисление они проводят на цитоплазматической мембране.

Гетеротрофная нитрификация[править | править код]

Особо выделяют гетеротрофную нитрификацию, происходящую у многих бактерий и грибов и связанную с окислением аммиака и азота органических соединений без использования полученной энергии, попутно с окислением органического вещества и, предположительно, посредством кислорода, образуемого при разложении пероксида водорода. Удельная активность этого процесса на 2-4 порядка ниже, чем в случае автотрофной нитрификации, однако именно с ним связано происхождение чилийской селитры а также вся нитрификация в почвах и водоемах с низкими значениями pH.

История изучения[править | править код]

Процесс был открыт в середине XIX века, первое предположение об участии микроорганизмов в нитрификации было сделано Луи Пастером, однако выделить их не удавалось, пока в 1891 С. Н. Виноградский не применил для этих целей селективную среду, содержащую только минеральные компоненты (чтобы избежать роста на ней банальных гетеротрофов) и в том числе сернокислый аммоний.

 

Аммиак, образующийся при аэробном и анаэробном разложении азотсодержащих органических веществ, окисляется двумя высокоспециализированными группами микроорганизмов в азотистую и затем азотную кислоты.

Этот процесс называется нитрификацией. Первыми исследователями, доказавшими его биологическую природу, были Т. Шлезинг и А. Мюнц (1879). На специфичность организмов, вызывающих нитрификацию» указывал Луи Пастер (1880). Однако длительное время их не удавалось выделить в чистую культуру. Лишь в 1890—1892 гг. С. Н. Виноградскому, применившему элективные среды, не содержащие органические вещества, удалось изолировать чистые культуры нитрификаторов. Им было установлено и существование двух групп нитрификатов, одна из которых окисляет аммиак до азотистой кислоты, а другая — азотистую кислоту в азотную. Последовательность в работе — двух или нескольких организмов называется метабиозом.

Нитрифицирующие бактерии входят в семейство Nitrobacteriaceae, имеют ряд общих свойств: все — облигатные аэробы, грамотрицательны, не образуют спор, развиваются при pH 7,5—8,0, оптимальная температура для их роста 25—30° С. Однако различные их роды существенно морфологически отличаются.

Первый этап нитрификации осуществляют бактерии пяти родов: Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosovibrio, Nitrosolobus; наиболее изучен род Nitrosomonas. В целях получения энергии для ассимиляции 1,5 г СO₂ и построения 1 г микробной плазмы нитрозные бактерии окисляют около 20 г аммиака и образуют 56 г азотистой кислоты; реакция: 2NH₃+3O₂ = 2HNO₂ + 2H₂O+158 кал. Окисление аммиака совершается в несколько стадий: на поверхности клетки — до гидроксиламина, далее уже внутри клетки — до гипонитрита и окиси азота.

Микроорганизмы, способные окислять нитриты в нитраты (осуществляющие вторую фазу нитрификации), относятся к родам Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrospina. Детально исследован род Nitrobacter. Все его представители имеют клетки грушевидной формы, размножаются почкованием, у дочерней клетки есть жгутик, оптимум развития при pH 7,7. Окисление азотистой кислоты в азотную идет также с выделением энергии: 2HNO₂ + O₂ -> 2HNO₃ + 48 кал. При построении 1 г вновь синтезированного органического вещества микробных тел окисляется 72 г HNO₂ и образуется 96 г HNO₃. Роль нитрификаторов в образовании нитратов грандиозна.

Воздействие органического вещества на нитрификаторы двояко: в лабораторных условиях даже ничтожные дозы органического вещества полностью подавляют рост и развитие организма, а в естественных условиях — нет. Причины этого различия не вполне ясны.

Наряду с нитрифицирующими автотрофными бактериями Д. У. Катлер и Б. К. Мукерджи (1931) выделили ряд гетеротрофных бактерий, способных окислять NH₄⁺ до NO₂, но значительно медленнее и только на первом этапе. В настоящее время установлены микроорганизмы, доводящие нитрификацию до конца, в частности гриб Aspergillus flavus и некоторые виды Atrobacter, нитрифицирующие аммиак.

К гетеротрофным нитрификаторам относят представителей родов: Alcaligenes, Corynebacterium, Achromobacter, Pseudomonas, Nocardia, Bacillus. Многие гетеротрофы могут осуществлять нитрификацию органических азотсодержащих соединений: амидов, аминов, оксидов, гидроксаматов и других, а также образовывать продукты, обладающие канцерогенными, токсичными, мутагенными свойствами. В условиях, неблагоприятных для развития автотрофных нитрифицирующих бактерий нитрификаторы-гетеротрофы, по-видимому, главенствуют в нитрификационном процессе.

19 Каждый микроорганизм может развиваться лишь в определенных пределах температуры. При изу­чении влияния температуры на рост прокариот выделяют темпера­турный диапазон, ограниченный минимальной и максимальной тем­пературами, при которых рост прекращается, а также область оптимальных температур с максимальной скоростью роста.

Положение на температурной шкале основных точек (минималь­ная, максимальная, оптимальная температуры), а также величина температурного диапазона роста прокариот сильно различаются.Поэтому по отношению к температуре микроорг-змы подразд-ют на 3 группы: мезофилы, психрофилы и термофилы.

(У мезофилов оптимальные температуры роста лежат между 30 и 40 °С, а темпера­турный диапазон, в котором возможен рост, находится между 10 и 45-50 °С (например Escherichia coli: нижняя граница роста — +10⁰С, верхняя — +49 °С, оптимальная темпера­тура — +37 °С при росте на богатой среде.)

У психрофилов (холодолюбивые микроорга­низмы) область температур роста лежит в пределах от —10 до +20 °С и выше.Они делятся на облигатных (обязательных) и факультатив­ных (необязательных), (основное различие между ними в том, что облигатные психрофилы не способны к росту при температуре выше 20 °С, а верхняя температурная граница роста факультативных форм намного выше. Таким образом, факультатив­ные психрофилы характеризуются более широким температурным диапазоном, при котором возможен их рост.)

Термофилов (теплолюбивые микроорганизмы) делят на 4 подгруппы.

1. Термотолерантные виды растут в пределах от 10 до 55—60 °С, оптимальная область лежит в пределах 35—40 °С. (Они способны расти при повышенных темпера­турах.)

2. Факультативные термофилы имеют максимальную температу­ру роста между 50 и 165 ⁰С, но способны к размножению при температуре 20 °С; оптимум приходится на область температур, близких к верхней границе роста. (Особенность этой группы прока­риот — способность к росту в области от 20 до 40 °С.)

3. К облигатным термофилам относят виды, обнаруживающие способность расти при температурах около 70 °С и не растущие ниже 40 ⁰С. (Оптимальная температурная область облигатных термофилов примыкает к их верхней температурной границе роста. Представи­тели: эубактерии Bacillusacidocaldarius, Synechococcus lividus, архебактерии Methanobacterium thermoautotrophicum, Thermo- plasma acidophilum и др.)

4. Экстремальные термофилы для них ха­рактерны: оптимальная гра­ница роста — в области 80— 105⁰С, минимальная — при 60 °С и выше, максимальная — до 110⁰С. (Thermoproteus, Pyrococcus, Pyrodictium и др.))

Наиболее термоустойчивыми являются бактериальные споры. У многих бактерий они способны выдерживать температуру кипе­ния воды в течение нескольких часов. Во влажной среде споры бак­терий гибнут при 120—130 °С через 20—30 мин, в сухом состоянии — при 160—170 °С через 1—2 ч. Термоустойчивость спор различных бактерий неодинакова; особенно устойчивы споры термофильных бактерий.

Механизм действия температуры на микроорганизмы. Отрицатель­ное влияние на жизнедеятельность микроорганизмов оказывает и низкая и высокая температура. Из-за низкой температуры за­медляются биохимические процессы и в случае образования кристаллов льда внутри клетки происходит повреждение и разрыв клеточных структур. Низкая температура вызывает бактериостатинеский эффект, который проявляется в прекращении роста и размножения бактерий.

Один из лучших ме­тодов длительного хранения скоропортящихся продуктов с мини­мальными изменениями их химического состава - консервирование низкими температурами. Низкие темпера­туры замедляют химические и биохимические процессы обмена веществ в тканях, снижают ферментативную активность, приоста­навливают развитие микроорганизмов. Консервирование низкими температурами проводят путем ох­лаждения или замораживания.

Охлаждением называется обработка и хранение пищевых про­дуктов при температуре, близкой к криоскопической, т. е. к тем­пературе замерзания клеточного сока, которая зависит от состава и концентрации сухих веществ. (Для яблок она колеблется от —1,4 до —2,8 °С, для винограда равна —3,8 °С, для лука —1,6, для рыбы —2, для мяса — 1,2 °С и ниже.) (При хранении охлажденных продуктов лучше, чем при замора­живании, сохраняются их натуральные свойства, но рост на них многих микроорганизмов не исключается, а лишь замедляется, по­этому сроки хранения охлажденных продуктов непродолжительны и зависят от температуры хранения и исходной степени обсемене­ния продукта психрофильными микроорганизмами.)

При замораживании происходит полная кристаллизация жидкой фазы продукта. Этот способ применяется для более длительного со­хранения мясных и рыбных продуктов, овощей, фруктов и др. (При длительном хранении замороженных продуктов изменяется их химический состав, гидролизуются и окисляются жиры, изменя­ется цвет, частично разрушаются витамины в результате их окисле­ния кислородом воздуха, ухудшается вкус и запах. При замораживании микрофлора полностью не уничтожается; особенно холодоустойчивы споровые формы микроорганизмов. Во время размораживания продуктов, особенно при вытекании из них сока, микроорганизмы вновь размножаются и вызывают порчу. С учетом этого оттаивать замороженные пищевые продукты следу­ет непосредственно перед употреблением. Кроме того, после размо­раживания продукта микроорганизмы возобновляют свою жизне­деятельность и могут привести к его быстрой порче, поэтому размо­роженные продукты необходимо сразу же перерабатывать. Качество продуктов в значительной степени зависит от способа его размора­живания. При быстром размораживании при повышенных темпе­ратурах происходят большие потери питательных веществ и более интенсивно развиваются микроорганизмы. Во время медленного размораживания при температурах от 0 до 4 °С кристаллы льда от­таивают постепенно, а коллоиды клеток более полно связывают образующуюся влагу.)

Наиболее губительна для микроорганизмов высокая температура, при которой происходит свертывание белка, вследствии чего происх-т нарушение актив­ности ферментов, проницаемости клеточной стенки и в рез-те чего нарушается равновесие всех биохимических процессов. Сущ-ют след. приемы уничтоже­ния микробов в пищевых продуктах при высоких температурах: варка, кипячение, обжарка, бланширование продуктов питания, пропаривание производственного оборудования. В пищевой промышл-сти применяют 2 способа воздействия высоких темпе­ратур на микроорганизмы: пастеризацию и стерилизацию.

Пастеризация — это нагревание продукта чаще при температуре 63—80 °С в течение 20-40 мин. Иногда пастеризацию производят кратковременным (в течение нескольких секунд) нагреванием до 90—100⁰С. При пастеризации погибают не все микроорганизмы. Поэтому пастеризованные продукты необходимо немедленно охлаждать до температуры не выше +10 "С и хранить на холоде, чтобы задержать прорастание спор и развитие сохранившихся клеток. Пастеризуют молоко, вино, соки, икру,, варенье, плодово-ягодные компоты и другие продукты. Иногда для удлинения сроков хранения продуктов проводят многократную пастеризацию — тиндализацию.

Стерилизация — это нагревание при температурах, которые вызывают гибель всех живых микроорганизмов. В микробиологической прак­тике стерилизуют среды, посуду, инструмент и другие необходимые предметы. Существуют различные способы стерилизации при помощи вы­сокой температуры.

Асептическое консервирование со­стоит в том, что жидкие и пюреобразные пищевые продукты под­вергают стерилизации путем кратковременного высокотемператур­ного нагрева, охлаждают, а затем расфасовывают в стерильную тару и укупоривают в асептических условиях (применяют для консервирования томата-пасты, плодово-ягодных соков, молока и других продуктов. Преимущество такого способа состоит в том, что сокращается время тепловой обработки продукта, в результате чего повышается пищевая ценность консервов, для упа­ковки могут быть использованы полимерные материалы.)