Основные параметры хроматографического разделения.

Содержание

 

Введение

Глава 1. Основные понятия и классификация методов жидкостной хроматографии

1.1 Аппаратура для жидкостной хроматографии

Глава 2. Сущность ВЭЖХ

2.1 Применение

Глава 3. Примеры использования ВЭЖХ в анализе объектов окружающей среды

Глава 4. Аппаратура для ВЭЖХ

Литература

Приложение

 

 

Введение

Хроматографические методы часто оказываются незаменимыми для идентификации и количественного определения органических веществ со сходной структурой. При этом наиболее широко используемыми для рутинных анализов загрязнителей окружающей среды являются газовая и высокоэффективная жидкостная хроматография. Газохроматографический анализ органических загрязнителей в питьевой и сточных водах сначала основывался на использовании насадочных колонок, позднее распространение получили и кварцевые капиллярные колонки. Внутренний диаметр капиллярных колонок составляет обычно 0,20-0,75 мм, длина - 30-105 м. Оптимальные результаты при анализе загрязнителей в воде достигаются чаще всего при использовании капиллярных колонок с различной толщиной пленки из метилфенилсиликонов с содержанием фенильных групп 5 и 50%. Уязвимым местом хроматографических методик с использованием капиллярных колонок часто становится система ввода пробы. Системы ввода пробы можно подразделить на две группы: универсальные и селективные. К универсальным относятся системы ввода с делением и без деления потока, “холодный” ввод в колонку и испарение при программировании температуры. При селективном вводе используют продувку с промежуточным улавливанием в ловушке, парофазный анализ и т.д. При использовании универсальных систем ввода в колонку поступает вся проба полностью, при селективной инжекции вводится только определенная фракция. Результаты, получаемые при селективном вводе, являются существенно более точными, поскольку попавшая в колонку фракция содержит только летучие вещества, и техника при этом может быть полностью автоматизирована.

Газохроматографические детекторы, используемые в мониторинге загрязнителей, часто подразделяют на универсальные, откликающиеся на каждый компонент в подвижной фазе, и селективные, реагирующие на присутствие в подвижной фазе определенной группы веществ со сходными химическими характеристиками. К универсальным относятся пламенно-ионизационный, атомно-эмиссионный, масс-спектрометрический детекторы и инфракрасная спектрометрия. Селективными детекторами, используемыми в анализе воды, являются электронно-захватный (селективен к веществам, содержащим атомы галогенов), термоионный (селективен к азот- и фосфорсодержащим соединениям), фотоионизационный (селективен к ароматическим углеводородам), детектор по электролитической проводимости (селективен к соединениям, содержащим атомы галогенов, серы и азота). Минимально детектируемые количества веществ - от нанограммов до пикограммов в секунду.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) является идеальным методом для определения большого числа термически неустойчивых соединений, которые не могут быть проанализированы с помощью газовой хроматографии. Объектами анализа методом жидкостной хроматографии в настоящее время часто становятся современные агрохимикаты, в число которых входят метилкарбонаты и фосфорорганические инсектициды, другие нелетучие вещества. Высокоэффективная жидкостная хроматография получает все большее распространение среди других методов, применяемых в мониторинге окружающей среды, еще и потому, что имеет блестящие перспективы в плане автоматизации пробоподготовки.

 

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ И КЛАССИФИКАЦИЯ МЕТОДОВ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

 

Жидкостную хроматографию подразделяют на несколько классов в зависимости от типа носителя неподвижной фазы. Простое аппаратурное оформление бумажной и тонкослойной хроматографий обусловили широкое использование этих методов в аналитической практике. Однако, большие возможности колоночной жидкостной хроматографии стимулировали совершенствование оборудования для этого классического метода и привели к быстрому внедрению ВЭЖХ. Пропускание элюента через колонку под высоким давлением позволило резко увеличить скорость анализа и существенно повысить эффективность разделения за счет использования мелкодисперсного сорбента. Метод ВЭЖХ в настоящее время позволяет выделять, количественно и качественно анализировать сложные смеси органических соединений.

По механизму взаимодействия разделяемого вещества (элюата) с неподвижной фазой различают адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, ион-парную, лигандообменную и аффинную хроматографии.

Адсорбционная хроматография. Разделение методом адсорбционной хроматографии осуществляется в результате взаимодействия разделяемого вещества с адсорбентом, таким как оксид алюминия или силикагель, имеющими на поверхности активные полярные центры. Растворитель (элюент) - неполярная жидкость. Механизм сорбции состоит в специфическом взаимодействии между полярной поверхностью сорбента и полярными (либо способными поляризоваться) участками молекул анализируемого компонента (рис. 1).

Рис. 1. Адсорбционная жидкостная хроматография.

Распределительная хроматография. При распределительном варианте жидкостной хроматографии разделение смеси веществ осуществляется за счет различия их коэффициентов распределения между двумя несмешивающимися фазами - элюентом (подвижной фазой) и фазой, находящейся на сорбенте (неподвижная фаза).

При нормально-фазовом варианте распределительной жидкостной хроматографии используются неполярный элюент и полярные группы, привитые к поверхности сорбента (чаще всего силикагеля). В качестве модификаторов поверхности силикагеля (привитых фаз) используются замещенные алкилхлорсиланы, содержащие полярные группы, такие как нитрильная, аминогруппа и т. д. (рис. 2). Применение привитых фаз позволяет тонко управлять сорбционными свойствами поверхности неподвижной фазы и добиваться высокой эффективности разделения.

 

Рис. 2. Распределительная хроматография с привитой фазой (нормально-фазный вариант).

Обращенно-фазовая жидкостная хроматография основана на распределении компонентов смеси между полярным элюентом и неполярными группами (длинными алкильными цепочками), привитыми к поверхности сорбента (рис. 3).

 

Рис. 3. Распределительная хроматография с привитой фазой (обращенно-фазный вариант).

 

Менее широко используется вариант жидкостной хроматографии с нанесенными фазами, когда жидкая неподвижная фаза наносится на неподвижный носитель.

Эксклюзивная (гельпроникающая) хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, в котором разделение веществ происходит за счет распределения молекул между растворителем, находящимся в порах сорбента и растворителем, протекающим между его частицами.

Аффинная хроматография основана на специфических взаимодействиях разделяемых белков (антител) с привитыми на поверхности сорбента (синтетической смолы) веществами (антигенов), избирательно образующими с белками комплексы (коньюгаты).

Ионообменная, ион-парная, лигандообменная хроматографии применяются в основном в неорганическом анализе.

ГЛАВА 2. СУЩНОСТЬ ВЭЖХ

 

В высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) характер происходящих процессов в хроматографической колонке, в общем идентичен с процессами в газовой хроматографии. Отличие состоит лишь в применении в качестве неподвижной фазы жидкости. В связи с высокой плотностью жидких подвижных фаз и большим сопротивлением колонок газовая и жидкостная хроматография сильно различаются по аппаратурному оформлению.

В ВЭЖХ в качестве подвижных фаз обычно используют чистые растворители или их смеси.

Для создания потока чистого растворителя (или смесей растворителей), называемого в жидкостной хроматографии элюентом, используются насосы, входящие в гидравлическую систему хроматографа.

Адсорбционная хроматография осуществляется в результате взаимодействия вещества с адсорбентами, такими как силикагель или оксид алюминия, имеющими на поверхности активные центры. Различие в способности к взаимодействию с адсорбционными центрами разных молекул пробы приводит к их разделению на зоны в процессе движения с подвижной фазой по колонке. Достигаемое при этом разделение зон компонентов зависит от взаимодействия, как с растворителем, так и с адсорбентом.

Наибольшее применение в ВЭЖХ находят адсорбенты из силикагеля с разным объемом, поверхностью и диаметром пор. Значительно реже используют оксид алюминия и другие адсорбенты. Основная причина этого:

- недостаточная механическая прочность, не позволяющая упаковывать и использовать при повышенных давлениях, характерных для ВЭЖХ;

силикагель по сравнению с оксидом алюминия обладает более широким диапазоном пористости, поверхности и диаметра пор; значительно большая каталитическая активность оксида алюминия приводит к искажению результатов анализа вследствие разложения компонентов пробы либо их необратимой хемосорбции.

Детекторы для ВЭЖХ

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) используется для детектирования полярных нелетучих веществ, которые по каким-либо причинам не могут быть переведены в форму удобную для газовой хроматографии, даже в виде производных. К таким веществам, в частности, относят сульфоновые кислоты, водорастворимые красители и некоторые пестициды, например производные фенил - мочевины.

Детекторы:

УФ - детектор на диодной матрице. «Матрица» фотодиодов (их более двухсот) постоянно регистрирует сигналы в УФ- и видимой области спектра, обеспечивая таким образом запись УФ-В-спектров в режиме сканирования. Это позволяет непрерывно снимать при высокой чувствительности неискаженные спектры быстро проходящих через специальную ячейку компонентов.

По сравнению с детектированием на одной длине волны, которое не дает информации о «чистоте» пика, возможности сравнения полных спектров диодной матрицы обеспечивают получение результата идентификации с гораздо большей степенью достоверности.

Флуоресцентный детектор. Большая популярность флуоресцентных детекторов объясняется очень высокой селективностью и чувствительностью, и тем фактором, что многие загрязнители окружающей среды флуоресцируют (например, полиароматические углеводороды).

Электрохимический детектор используются для детектирования веществ, которые легко окисляются или восстанавливаются: фенолы, меркаптаны, амины, ароматические нитро- и галогенпроизводные, альдегиды кетоны, бензидины.

Хроматографическое разделение смеси на колонке вследствие медлен-ного продвижения ПФ занимает много времени. Для ускорения процесса хроматографирование проводят под давлением. Этот метод называют вы-сокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЖХ)

Модернизация аппаратуры, применяемой в классической жидкостной колоночной хроматографии, сделала ее одним из перспективных и совре-менных методов анализа. Высокоэффективная жидкостная хроматография является удобным способом разделения, препаративного выделения и про-ведения качественного и количественного анализа нелетучих термола-бильных соединений как с малой, так с большой молекулярной массой.

В зависимости от типа применяемого сорбента в данном методе используют 2 варианта хроматографирования: на полярном сорбенте с использованием неполярного элюента (вариант прямой фазы) и на неполярном сорбенте с использованием полярного элюента - так называемая обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОфВЖХ).

При переходе элюента к элюенту равновесие в условиях ОфВЖХ устанавливается во много раз быстрее, чем в условиях полярных сорбентов и неводных ПФ. Вследствие этого, а также удобства работы с водными и водно-спиртовыми элюентами, ОфВЖХ получила в настоящее время большую популярность. Большинство анализов при помощи ВЖХ проводят именно этим методом.

Детекторы. Регистрация выхода из колонки отдельного компонента производится с помощью детектора. Для регистрации можно использовать изменение любого аналитического сигнала, идущего от подвижной фазы и связанного с природой и количеством компонента смеси. В жидкостной хроматографии используют такие аналитические сигналы, как светопоглощение или светоиспускание выходящего раствора (фотометрические и флуориметрические детекторы), показатель преломления (рефрактометрические детекторы), потенциал и электрическая проводимость (электрохимические детекторы) и др.

Непрерывно детектируемый сигнал регистрируется самописцем. Хроматограмма представляет собой зафиксированную на ленте самописца по-следовательность сигналов детектора, вырабатываемых при выходе из ко-лонки отдельных компонентов смеси. В случае разделения смеси на внеш-ней хроматограмме видны отдельные пики. Положение пика на хроматограмме используют для целей идентификации вещества, высоту или площадь пика - для целей количественного определения.

Применение

 

Наиболее широкое применение ВЭЖХ находит в следующих областях химического анализа (выделены объекты анализа, где ВЭЖХ практически не имеет конкуренции):

· Контроль качества продуктов питания — тонизирующие и вкусовые добавки, альдегиды, кетоны, витамины, сахара, красители, консерванты, гормональные препараты, антибиотики, триазиновые, карбаматные и др. пестициды, микотоксины, нитрозоамины, полициклические ароматические углеводороды и т.п.

· Охрана окружающей среды — фенолы, органические нитросоединения, моно— и полициклические ароматические углеводороды, ряд пестицидов, главные анионы и катионы.

· Криминалистика — наркотики, органические взрывчатые вещества и красители, сильнодействующие фармацевтические препараты.

· Фармацевтическая промышленность — стероидные гормоны, практически все продукты органического синтеза, антибиотики, полимерные препараты, витамины, белковые препараты.

· Медицина — перечисленные биохимические и лекарственные вещества и их метаболиты в биологических жидкостях (аминокислоты, пурины и пиримидины, стероидные гормоны, липиды) при диагностике заболеваний, определении скорости выведения лекарственных препаратов из организма с целью их индивидуальной дозировки.

· Сельское хозяйство — определение нитрата и фосфата в почвах для определения необходимого количества вносимых удобрений, определение питательной ценности кормов (аминокислоты и витамины), анализ пестицидов в почве, воде и сельхозпродукции.

· Биохимия, биоорганическая химия, генная инженерия, биотехнология — сахара, липиды, стероиды, белки, аминокислоты, нуклеозиды и их производные, витамины, пептиды, олигонуклеотиды, порфирины и др.

· Органическая химия — все устойчивые продукты органического синтеза, красители, термолабильные соединения, нелетучие соединения; неорганическая химия (практически все растворимые соединения в виде ионов и комплексных соединений).

· контроль качества и безопасности продуктов питания, алкогольных и безалкогольных напитков, питьевой воды, средств бытовой химии, парфюмерии на всех стадиях их производства;

· определение характера загрязнений на месте техногенной катастрофы или чрезвычайного происшествия;

· обнаружение и анализ наркотических, сильнодействующих, ядовитых и взрывчатых веществ;

· определение наличия вредных веществ (полициклические и другие ароматические углеводороды, фенолы, пестициды, органические красители, ионы тяжелых, щелочных и щелочно-земельных металлов) в жидких стоках, воздушных выбросах и твердых отходах предприятий и в живых организмах;

· мониторинг процессов органического синтеза, нефте- и углепереработки, биохимических и микробиологических производств;

анализ качества почв для внесения удобрений, наличия пестицидов и гербицидов в почве, воде и в продукции, а также питательной ценности кормов; сложные исследовательские аналитические задачи; получение микроколичества сверхчистого вещества.

ГЛАВА 3. ПРИМЕРЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВЭЖХ В АНАЛИЗЕ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

SURVEYOR

Карусель 96 образцов.

Электрический привод, термостат колонки, петля Valco (100 мкл - стандарт) с возможностью частичного заполнения.Режим AutoMix для подготовки проб. Карусель для образцов: 84 х 2 мл (образцы) + Зх 10 мл (реагенты). Встроенный термостат колонки. 420

Петлевой автосэмплер для исследовательских работ с возможностью работы в режимах полного, частичного заполнения и ввода микролитровых проб. Широкий выбор каруселей (стандартная — 96 образцов).

Планшетный автосэмплер для работы с 96- и 384-позиционными планшетами. Ввод пробы в петлю под давлением, возможность ввода проб менее 1 мкл. Возможность установки податчика планшетов. ВЭЖХ

Литература

1.Пилипенко А.Т., Пятницкий И.В. Аналитическая химия. В двух книгах: кн..1 – М.: Химия, 1990,-480с.

1. Пилипенко А.Т., Пятницкий И.В. Аналитическая химия. В двух книгах: кн..2 – М.: Химия, 1990,-480с.

2. Васильєв В.П. Аналитическая химия. В 2 ч. Ч. 2. Физико – химические методы анализа: Учеб. для Химко – технол. спец. вузов. – М.: Высш. шк., 1989. – 384с.

3. Гидрохимические материалы. Том 100. Методы и технические средства оперативного мониторинга качества поверхностных вод. Л.: Гидрометео-издат, 1991. – 200с.

4. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия производственных сточных вод / Ю.Ю. Лурье; М.: ХимияЮ, 1984. - 448с.

5. Юинг Г. Инструментальные методы химического анализа / Пер. с англ. М.: Мир, 1989. – 348 с.

6. Горелик Д.О., Конопелько Л.А., Панков Э.Д. Экологический мониторинг. В 2 т. СПб.: Крисмас. 2000. – 260 с.

7. Айвазов Б.В. Введение в хроматографию. М.: Высш. шк., 1983. – 450 с.

8. Гольдберг К.А., Вигдергауз М.С. Введение в газовую хроматографию. М.: Химия, 1990. – 329 с.

9. Столяров Б.В. и др. // Практическая газовая и жидкостная хроматография. СПб.: СПбГУ, 1998. - С. 81.

Приложение

Вводная часть

Фирма-производитель: ФМС (США).

Торговое название: КОММАНД.

Действующее вещество: кломазон.

2-(2-хлорбензил)-4,4-диметил-3-изоксалидин-3-он(ИЮПАК)

Светло-коричневая вязкая жидкость.

Температура плавления: 25 -С.

Температура кипения: 275 -С.

Давление паров при 25 -С: 19,2 мПа.

Коэффициент распределения н-октанол/вода: K logP = 2,5.

Хорошо растворим в ацетоне, гексане, этаноле, метаноле,

хлороформе, дихлорметане и ацетонитриле; растворимость в воде -

1,10 г/куб. дм. Стабилен при комнатной температуре не менее 2 лет, при 50 -С - не менее 3 месяцев.

Краткая токсикологическая характеристика: Острая пероральная

токсичность (LD) для крыс - 1369 - 2077 мг/кг; острая дермальная

токсичность (LD) для крыс - более 2000 мг/кг; острая

ингаляционная токсичность (LC) для крыс - 4,8 мг/куб. дм (4 ч).

Гигиенические нормативы. ПДК в воде - 0,02 мг/куб. дм.

Область применения препарата. Кломазон - гербицид избирательного действия, применяемый для борьбы со злаковыми и двудольными сорными растениями в посевах сои и риса при довсходовом или предпосевном внесении.

2. Методика определения кломазона в воде

Приборы, аппаратура, посуда

Жидкостный хроматограф Милихром

с ультрафиолетовым детектором

Хроматографическая колонка стальная,

длиной 64 мм, внутренним диаметром 2 мм,

заполненная Силасорбом 600, зернением 5 мкм

Хроматограф газовый серии "Цвет" или

аналогичный, снабженный детектором постоянной

скорости рекомбинации (ДПР) с пределом

детектирования по линдану 4 x 10 г/куб. см

Хроматографическая колонка стеклянная, длиной

1 или 2 м, внутренним диаметром 2 - 3 мм

Микрошприц типа МШ-10, вместимостью 10 мкл ТУ 5Е2-833-024

Аппарат для встряхивания типа АВУ-6с ТУ 64-1-2851-78

Баня водяная ТУ 64-1-2850-76

Весы аналитические типа ВЛА-200 ГОСТ 34104-80Е

Камера хроматографическая ГОСТ 10565-74

Насос водоструйный ГОСТ 10696-75

Облучатель ртутно-кварцевый типа ОКН-11 ТУ 64-1-1618-77

Пульверизаторы стеклянные ГОСТ 10391-74

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М

или аналогичный ТУ 25-11-917-76

Установка компрессорная ТУ 64-1-2985-78

Шкаф сушильный ТУ 64-1-1411-76Е

Воронки делительные ГОСТ 3613-75

Колбы мерные, вместимостью 100 мл ГОСТ 1770-74

Цилиндры мерные, вместимостью 10, 50 мл ГОСТ 1770-74Е

Колбы грушевидные со шлифом,

вместимостью 100 мл ГОСТ 10394-72

Колбы конические, вместимостью 100 мл ГОСТ 22524-77

Пробирки центрифужные, мерные ГОСТ 25336-82Е

Пипетки, вместимостью 0,1, 1, 2, 5 и 10 мл ГОСТ 20292-74

Воронки химические, конусные, диаметром

34 - 40 мм ГОСТ 25336-82Е

Отбор проб

Отбор, хранение и подготовка проб проводятся в соответствии с

"Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", утвержденными за N 2051-79 от 21.08.79

Отобранные пробы можно хранить в холодильнике не более 5 дней. Перед анализом воду (при наличии взвеси) фильтруют через неплотный бумажный фильтр.

Подготовка к определению

2.5.1. Метод ВЭЖХ

2.5.1.1. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают с помощью пипетки 5 мл изопопанола и 5 мл метанола, доливают до метки гексаном, перемешивают, фильтруют.

2.5.1.2. Кондиционирование колонки

Промыть колонку для ВЭЖХ смесью гексан-метанол-изопропанол (90:5:5, по объему) в течение 30 мин. при скорости подачи растворителя 100 мкл/мин.

2.5.2. Метод ГЖХ. Подготовка и кондиционирование колонки

Готовую насадку (5% SE-30 на Хроматоне N-AW-DMCS) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостате хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 250 -С в течение 10 -12 ч.

2.5.3. Метод ТСХ

2.5.3.1. Приготовление проявляющих реагентов

2.5.3.1.1. Проявляющий реагент N 1

1 г нитрата серебра растворяют в 1 мл дистиллированной воды, добавляют 10 мл 2-феноксиметанола, 190 мл ацетона, 1 - 2 капли пероксида водорода, раствор перемешивают и переносят в склянку из темного стекла.

2.5.3.2.2. Проявляющий реагент N 2

0,5 г нитрата серебра растворяют в 5 мл дистиллированной воды в мерной колбе на 100 мл, добавляют 10 мл 25%-ного водного аммиака, раствор доводят до 100 мл ацетоном, перемешивают и переносят в склянку из темного стекла.

2.5.3.2. Приготовление подвижной фазы для ТСХ

В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 20 мл ацетона и добавляют до метки гексан, перемешивают. Смесь наливают в хроматографическую камеру слоем не более 6 - 8 мм за 30 мин. До начала хроматографирования.

Требования техники безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами.

Содержание

 

Введение

Глава 1. Основные понятия и классификация методов жидкостной хроматографии

1.1 Аппаратура для жидкостной хроматографии

Глава 2. Сущность ВЭЖХ

2.1 Применение

Глава 3. Примеры использования ВЭЖХ в анализе объектов окружающей среды

Глава 4. Аппаратура для ВЭЖХ

Литература

Приложение

 

 

Введение

Хроматографические методы часто оказываются незаменимыми для идентификации и количественного определения органических веществ со сходной структурой. При этом наиболее широко используемыми для рутинных анализов загрязнителей окружающей среды являются газовая и высокоэффективная жидкостная хроматография. Газохроматографический анализ органических загрязнителей в питьевой и сточных водах сначала основывался на использовании насадочных колонок, позднее распространение получили и кварцевые капиллярные колонки. Внутренний диаметр капиллярных колонок составляет обычно 0,20-0,75 мм, длина - 30-105 м. Оптимальные результаты при анализе загрязнителей в воде достигаются чаще всего при использовании капиллярных колонок с различной толщиной пленки из метилфенилсиликонов с содержанием фенильных групп 5 и 50%. Уязвимым местом хроматографических методик с использованием капиллярных колонок часто становится система ввода пробы. Системы ввода пробы можно подразделить на две группы: универсальные и селективные. К универсальным относятся системы ввода с делением и без деления потока, “холодный” ввод в колонку и испарение при программировании температуры. При селективном вводе используют продувку с промежуточным улавливанием в ловушке, парофазный анализ и т.д. При использовании универсальных систем ввода в колонку поступает вся проба полностью, при селективной инжекции вводится только определенная фракция. Результаты, получаемые при селективном вводе, являются существенно более точными, поскольку попавшая в колонку фракция содержит только летучие вещества, и техника при этом может быть полностью автоматизирована.

Газохроматографические детекторы, используемые в мониторинге загрязнителей, часто подразделяют на универсальные, откликающиеся на каждый компонент в подвижной фазе, и селективные, реагирующие на присутствие в подвижной фазе определенной группы веществ со сходными химическими характеристиками. К универсальным относятся пламенно-ионизационный, атомно-эмиссионный, масс-спектрометрический детекторы и инфракрасная спектрометрия. Селективными детекторами, используемыми в анализе воды, являются электронно-захватный (селективен к веществам, содержащим атомы галогенов), термоионный (селективен к азот- и фосфорсодержащим соединениям), фотоионизационный (селективен к ароматическим углеводородам), детектор по электролитической проводимости (селективен к соединениям, содержащим атомы галогенов, серы и азота). Минимально детектируемые количества веществ - от нанограммов до пикограммов в секунду.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) является идеальным методом для определения большого числа термически неустойчивых соединений, которые не могут быть проанализированы с помощью газовой хроматографии. Объектами анализа методом жидкостной хроматографии в настоящее время часто становятся современные агрохимикаты, в число которых входят метилкарбонаты и фосфорорганические инсектициды, другие нелетучие вещества. Высокоэффективная жидкостная хроматография получает все большее распространение среди других методов, применяемых в мониторинге окружающей среды, еще и потому, что имеет блестящие перспективы в плане автоматизации пробоподготовки.

 

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ И КЛАССИФИКАЦИЯ МЕТОДОВ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

 

Жидкостную хроматографию подразделяют на несколько классов в зависимости от типа носителя неподвижной фазы. Простое аппаратурное оформление бумажной и тонкослойной хроматографий обусловили широкое использование этих методов в аналитической практике. Однако, большие возможности колоночной жидкостной хроматографии стимулировали совершенствование оборудования для этого классического метода и привели к быстрому внедрению ВЭЖХ. Пропускание элюента через колонку под высоким давлением позволило резко увеличить скорость анализа и существенно повысить эффективность разделения за счет использования мелкодисперсного сорбента. Метод ВЭЖХ в настоящее время позволяет выделять, количественно и качественно анализировать сложные смеси органических соединений.

По механизму взаимодействия разделяемого вещества (элюата) с неподвижной фазой различают адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, ион-парную, лигандообменную и аффинную хроматографии.

Адсорбционная хроматография. Разделение методом адсорбционной хроматографии осуществляется в результате взаимодействия разделяемого вещества с адсорбентом, таким как оксид алюминия или силикагель, имеющими на поверхности активные полярные центры. Растворитель (элюент) - неполярная жидкость. Механизм сорбции состоит в специфическом взаимодействии между полярной поверхностью сорбента и полярными (либо способными поляризоваться) участками молекул анализируемого компонента (рис. 1).

Рис. 1. Адсорбционная жидкостная хроматография.

Распределительная хроматография. При распределительном варианте жидкостной хроматографии разделение смеси веществ осуществляется за счет различия их коэффициентов распределения между двумя несмешивающимися фазами - элюентом (подвижной фазой) и фазой, находящейся на сорбенте (неподвижная фаза).

При нормально-фазовом варианте распределительной жидкостной хроматографии используются неполярный элюент и полярные группы, привитые к поверхности сорбента (чаще всего силикагеля). В качестве модификаторов поверхности силикагеля (привитых фаз) используются замещенные алкилхлорсиланы, содержащие полярные группы, такие как нитрильная, аминогруппа и т. д. (рис. 2). Применение привитых фаз позволяет тонко управлять сорбционными свойствами поверхности неподвижной фазы и добиваться высокой эффективности разделения.

 

Рис. 2. Распределительная хроматография с привитой фазой (нормально-фазный вариант).

Обращенно-фазовая жидкостная хроматография основана на распределении компонентов смеси между полярным элюентом и неполярными группами (длинными алкильными цепочками), привитыми к поверхности сорбента (рис. 3).

 

Рис. 3. Распределительная хроматография с привитой фазой (обращенно-фазный вариант).

 

Менее широко используется вариант жидкостной хроматографии с нанесенными фазами, когда жидкая неподвижная фаза наносится на неподвижный носитель.

Эксклюзивная (гельпроникающая) хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, в котором разделение веществ происходит за счет распределения молекул между растворителем, находящимся в порах сорбента и растворителем, протекающим между его частицами.

Аффинная хроматография основана на специфических взаимодействиях разделяемых белков (антител) с привитыми на поверхности сорбента (синтетической смолы) веществами (антигенов), избирательно образующими с белками комплексы (коньюгаты).

Ионообменная, ион-парная, лигандообменная хроматографии применяются в основном в неорганическом анализе.

Основные параметры хроматографического разделения.

Основными параметрами хроматографического разделения являются удерживаемый объем и время удерживания компонента смеси (рис. 4).

Время удерживания tR - это время, прошедшее от момента ввода пробы в колонку до выхода максимума соответствующего пика. Умножив время удерживания на объемную скорость элюента F , получим удерживаемый объем VR:

 

VR = tR ^. F ;

 

Исправленое время удерживания - время, прошедшее с момента появления максимума пика несорбируемого компонента до пика соответствующего соединения:

tR' = tR - t0;

 

Приведенный или исправленный объем удерживания - это объем удерживания с поправкой на мертвый объем колонки V0, т. е. на объем удерживания несорбируемого компонента:

VR' = VR - V0;

 

Характеристикой удерживания является также коэффициент емкости k', определяемый как отношение массы вещества в неподвижной фазе к массе вещества в подвижной фазе: k' = mн / mп;

Величину k' легко определить по хроматограмме:

 

 

Важнейшими параметрами хроматографического разделения являются его эффективность и селективность.

Эффективность колонки, измеряемая высотой теоретических тарелок (ВЭТТ) и обратно пропорциональная их числу (N) тем выше, чем уже пик вещества, выходящего при том же времени удерживания. Значение эффективности может быть вычислено по хроматограмме по следующей формуле:

N = 5.54 ^. (tR /  1/2)²,

 

где tR - время удерживания,

w 1/2 - ширина пика на половине высоты

Зная число теоретических тарелок, приходящееся на колонку, длину колонки L и средний диаметр зерна сорбента dc, легко получить значения высоты, эквивалентной теоретической тарелке (ВЭТТ), и приведенной высоты (ПВЭТТ):

ВЭТТ = L/N ПВЭТТ = ВЭТТ/d_c

 

Эти характеристики позволяют сравнивать эффективности колонок различных типов, оценивать качество сорбента и качество заполнения колонок.

Селективность разделения двух веществ определяется по уравнению:

 

,

 

При рассмотрении разделения смеси двух компонентов важным параметром служит также степень разделения RS:

 

;

 

Пики считаются разрешенными, если величина RS больше или равна 1.5.

Основные хроматографические параметры связывает следующее уравнение для разрешения:

 

;

 

Факторами, определяющими селективность разделения, являются:

1) химическая природа сорбента;

2) состав растворителя и его модификаторов;

3) химическая структура и свойства компонентов разделяемой смеси;

4) температура колонки