Выделение чистых культур микроорганизмов.

Чистой культурой называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Выделение чистых культур бактерий - обязательный этап бактериологического исследования в лабораторной диагностике инфекционных болезней, в изучении микробной загрязненности различных объектов окружающей среды, и, в целом, при любой работе с микроорганизмами. Исследуемый материал (гной, мокрота, фекалии, кровь и другой материал от больных; вода, почва, воздух, пищевые продукты, трупы животных и человека, переносчики) обычно содержит ассоциации микробов.
Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая и типовая принадлежность возбудителя, то есть производится его идентификация.
Для выделения чистых культур микроорганизмов используют методы, которые можно разделить на несколько групп.

· Метод Пастера - последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме (имеет историческое значение).

· Метод Коха («пластинчатые разводки») - последовательное разведение исследуемого материала в расплавленном агаре (температура 48-50 ° С), с последующим разливом в чашки Петри, где агар застывает. Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений, где бактерий становится мало и, в дальнейшем, при росте на чашках Петри появляются изолированные колонии, образующиеся из одной исходной материнской клетки. Из изолированных колоний в глубине агара получают чистую культуру бактерий пересевом на свежие среды.

· Метод Шукевича - применяется для получения чистой культуры протея и других микроорганизмов обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсационную воду у основания скошенного агара. Подвижные микробы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару, неподвижные формы остаются расти внизу на месте посева. Пересевая верхние края культуры можно получить чистую культуру.

· Метод Дригальского - широко применяется в бактериологической практике, при этом исследуемый материал разводят в пробирке стерильным физиологическим раствором или бульоном. Одну каплю материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках. С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга. Через 1-7 сут выдерживания чашек в термостате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на третьей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопления чистой культуры.

· Метод Вейнберга. Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев производят по методу Дригальского, но после этого чашки сразу помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведения исследуемого материала проводят в расплавленной и охлажденной до 45-50 ° С агаризированной питательной среде. Делают 6-10 последовательных разведений, затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем смеси парафина и вазелинового масла, чтобы помешать проникновению воздуха в толщу питательной среды. Иногда питательную среду после посева и перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри или капиллярные пипетки Пастера, концы которых запаивают. При удачном разведении в пробирках, трубках Бурри, пипетках Пастера вырастают изолированные колонии анаэробов. Чтобы изолированные колонии хорошо были видны, используют осветленные питательные среды. Для извлечения изолированных колоний анаэробов, пробирку слегка нагревают, вращая ее над пламенем, при этом агар, прилегающий к стенкам, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным пинцетом и извлекают колонии петлей. Извлеченные колонии помещают в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов (например, среду Китта-Тароцци). Агаризированную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.

· Метод Хангейта - когда хотят получить изолированные колонии бактерий с особенно высокой чувствительностью к кислороду (ст рогие аэробы) используют метод вращающихся пробирок Хангейта. Для этого расплавленную агаризированную среду засевают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку, среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.

· Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор - прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. На предметном столике микроскопа устанавливают влажную камеру, в которую помещают препарат «висячая капля». В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки (микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов. Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой для получения клона клеток.

МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ.

Почти все факторы физического воздействия на микроорганизмы могут быть использованы с целью стерилизации. Под стерилизацией понимают обеспложивание, освобождение материалов, растворов, питательных сред от вегетативных и покоящихся форм микроорганизмов. Стерильность - понятие абсолютное, оно означает полное отсутствие микроорганизмов, как на поверхности, так и внутри стерильного объекта.

В практике широко используют несколько способов стерилизации: термическая (под действие высоких температур) и холодная (с помощью ультразвука, излучения, фильтрации).
Гибель клеток бактерий, грибов, дрожжей и вирусных частиц при стерилизации высокой температурой происходит либо в результате сгорания клеток, либо в результате коагуляции белковых структур микроорганизмов. Различают следующие способы тепловой стерилизации:
Прокаливание - это самый старый и надежный способ стерилизации. В пламени горелки прокаливают бактериологические петли, препаровальные иглы, кончики пинцетов и ножниц, предметные стекла. При этом бактерии, грибы и их споры сгорают.
Кипячение - для стерилизации металлических инструментов, стеклянных изделий, резиновых трубок, пробок используют кипящую воду. При 100 ° С (температура кипящей воды) вегетативные формы микроорганизмов и большинство вирусов погибают быстро, в течение нескольких минут. Споры (бациллы сибирской язвы, ботулизма) выдерживают кипячение в течение нескольких часов, вирусы гепатита В - около часа. Стерилизацию осуществляют в специальных металлических сосудах - стерилизаторах, которые могут быть снабжены электро-нагревом. Существует большое количество типов стерилизаторов, отличающихся по объему и устройству.
Стерилизация сухим жаром - Для стеклянной посуды чаще всего используют стерилизацию сухим жаром. Ее проводят в специальных суховоздушных (сухожарочных) шкафах, имеющих датчики - регуляторы температуры. Режимы стерилизации включают температуру и время. Наиболее часто используют следующие режимы стерилизации сухим жаром:

При таких режимах погибают как вегетативные формы, так и споры микроорганизмов.
Автоклавирование - стерилизация насыщенным паром под давлением. Проводится при температуре выше точки кипения воды. Это наиболее надежный и распространенный способ стерилизации. Особая эффективность этого способа достигается при совместном действии пара и высокой температуры. Стерилизацию паром под давлением осуществляют в специальных герметически закрывающихся аппаратах с толстыми стенками - автоклавах. Автоклав состоит из стерилизационной камеры, снабженной краном для выхода воздуха, манометром для измерения давления пара, предохранительным клапаном для выхода пара при повышении давления выше необходимого, термометра для измерения температуры внутри камеры. Имеется паровой котел с нагревателем воды. При кипячении воды пар поступает в камеру автоклава. Автоклав герметически закрывают крышкой или дверью с плотной резиновой прокладкой. Автоклавирование проводит специально подготовленный специалист, так как работа по обслуживанию аппарата, работающего под давлением требует подготовки и строгого соблюдения правил техники безопасности. Режим автоклавирования выражают в единицах избыточного давления и продолжительности времени. Избыточное давление в 1 атм устанавливается при достижении температуры в камере 121 °C, 1,5 атм - 125 °C, 2,0 атм - 134 °C. При таких режимах автоклавирования вегетативные формы микроорганизмов погибают в течение нескольких минут, а споры в течение 20-30 мин. Режим стерилизации выбирают в зависимости от свой ств ст ерилизуемого материала. Так, питательные среды стерилизуют 20-30 мин при 1 атм, перевязочный материал и резиновые изделия от 1 до 2 часов при 1,0-1,5 атм. Для контроля режима стерилизации используют вещества с определенной температурой плавления. Их смешивают с метиленовой синью, помещают в ампулы или небольшие флаконы и раскладывают в автоклаве перед началом автоклавирования. К таким контролирующим веществам относятся бензаурин, температура плавления 115 °C, соответствует - 0,5 атм; бензойная кислота, температура плавления 121 °C, соответствует - 1,0 атм; мочевина, температура плавления 132 °C, соответствует - 2,0 атм; глюкоза, температура плавления 146 °C; тиомочевина, температура плавления 180 °C. Эти вещества расплавляются при достижении в сосуде соответствующей температуры и окрашиваются в цвет добавленного красителя.

Стерилизации текучим паром подвергаются те растворы и питательные среды, которые разрушаются при стерилизации под давлением. Такую стерилизацию проводят также в автоклавах при избыточном нулевом давлении и температуре 100 °C. Применяют «дробную стерилизацию» - трех- или четырехкратную обработку с интервалом в 1 сутки, во время которого не успевшие погибнуть споры бактерий прорастают в вегетативные формы и погибают от действия пара и температур.
Пастеризация предусматривает уничтожение в материале только вегетативных форм микроорганизмов и применяется в пищевой промышленности. При этом используют кратковременное нагревание до 90-92 °С в течение 2-5 сек или более длительное - в течение 5-10 мин нагревание до 70-75 °С. Обработанные таким образом материалы считаются пастеризованными, но не стерильными, так как содержат споры.
Холодная стерилизация осуществляется в отношении материалов, сред и растворов, которые изменяют свойства при тепловой стерилизации. Стерилизация фильтрованием показана для синтетических сред определенного состава, содержащих термолабильные аминокислоты, витамины, белки, для антибиотиков, ароматических углеводородов. Фильтрование проводится через мелкопористые материалы, которые адсорбируют клетки микроорганизмов: каолин, асбест, фарфор и др. Диски, изготовленные из асбеста с целлюлозой называют фильтрами Зейтца. Их помещают в специальный фильтродержатель и стерилизуют в автоклаве, а затем, смонтировав держатель с колбой или бутылью, под давлением пропускают стерилизуемый раствор. Широкое применение нашли мембранные фильтры. Их изготавливают из специально обработанной нитроцеллюлозы. Фильтры имеют поры размером от 0,22 до 100 мм. В фильтродержатели монтируют фильтры с разной величиной пор, от больших к меньшим и при фильтрации растворов постепенно «отсеивают» микроорганизмы различных размеров. Наиболее широко известны фильтрующие пластины фирм «Миллипор», «Синпор», «Владипор». После стерилизующей фильтрации среды и растворы обязательно проверяют на стерильность, помещая микропробы простерилизованных растворов в термостат при температуре 37 ° С.