Определение аминокислотной последовательности в белке — КиберПедия 

Эмиссия газов от очистных сооружений канализации: В последние годы внимание мирового сообщества сосредоточено на экологических проблемах...

Папиллярные узоры пальцев рук - маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни...

Определение аминокислотной последовательности в белке

2018-01-13 296
Определение аминокислотной последовательности в белке 0.00 из 5.00 0 оценок
Заказать работу

Определение N-концевой аминокислоты в белке и последовательности аминокислот в олигопептидах

Фенилизотиоционат (ФИТЦ) - реагент, используемый для определения N-концевой аминокислоты в пептиде. Он способен реагировать с α-аминогруппой и α-карбоксильной группой свободных аминокислот, а также с N-концевой аминокислотой в пептидах (см. схему ниже).

В результате взаимодействия с N-концевой аминокислотой полипептида образуется фенил-тиогидантионовое производное, в котором дестабилизирована пептидная связь между α-карбоксильной группой N-концевой аминокислоты и α-аминогруппой второй аминокислоты в пептиде. Эта связь избирательно гидролизуется без повреждения других пептидных связей.

После реакции выделяют комплекс ФИТЦ-АК1, идентифицируют его хроматографическими методами. ФИТЦ можно использовать вновь с укороченным пептидом, полученным в предыдущем цикле, для определения следующей аминокислоты. Этот процесс ступенчатого расщепления пептида с N-конца был автоматизирован и реализован в приборе - секвенаторе, с помощью которого можно определять последовательность аминокислотных остатков в олигопептидах, состоящих из 10-20 аминокислот.

Многие полипептиды имеют первичную структуру, состоящую более чем из 100 аминокислот. Так как с помощью секвенаторов наиболее продуктивно определяют аминокислотную последовательность лишь небольших пептидов, молекулы полипептида расщепляют по специфическим местам на фрагменты.

Используя несколько разных расщепляющих агентов (ими могут быть ферменты или химические вещества) в разных пробах очищенного полипептида, можно получить частично перекрывающие друг друга фрагменты с установленной аминокислотной последовательностью. С их помощью можно воссоздать правильный порядок фрагментов и получить полную последовательность аминокислот в полипептидной цепи.

Ферментативное расщепление полипептида по специфическим участкам

Для специфического расщепления пептидных связей в белке можно использовать несколько разных ферментов. Наиболее широко используют ферментативный гидролиз полипептида протеолитическим ферментом - трипсином, который относят к группе пищеварительных ферментов (его вырабатывает поджелудочная железа). Фермент обладает высокой специфичностью действия. Он расщепляет пептидные связи, в образовании которых участвует карбоксильная группа остатков лизина или аргинина.

Исходя из установленного количества остатков лизина и аргинина, можно предсказать количество получаемых при гидролизе трипсином фрагментов. Так, если в полипептидной цепи 6 остатков аргинина и лизина, то при расщеплении трипсином можно получить 7 фрагментов. Затем в каждом фрагменте устанавливают аминокислотную последовательность.

 

Схема

Химическое расщепление полипептида по специфическим участкам

В некоторых случаях предпочтителен не ферментативный, а химический гидролиз. Так, реагент бромциан расщепляет только пептидные связи, в которых карбоксильная группа принадлежит остатку метионина. Зная количество остатков метионина в полипептидной цепи, легко установить количество получаемых фрагментов. Далее для каждого фрагмента в секвенаторе также устанавливают аминокислотную последовательность.

Получение аминокислотной последовательности полипептида с помощью перекрывающихся фрагментов

Для успешного установления последовательности полученных фрагментов полипептида необходимо получить пептиды с перекрывающимися аминокислотными последовательностями. Это достигают обработкой отдельных проб данного полипептида разными реагентами, расщепляющими белок в разных местах. Необходимо провести столько расщеплений, чтобы получить набор пептидов, обеспечивающих перекрывание всех участков, необходимых для определения последовательности исходного полипептида.

Рис. 4. Установление первичной структуры белка с помощью перекрывающихся пептидных фрагментов.

 


Поделиться с друзьями:

Папиллярные узоры пальцев рук - маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни...

История создания датчика движения: Первый прибор для обнаружения движения был изобретен немецким физиком Генрихом Герцем...

История развития пистолетов-пулеметов: Предпосылкой для возникновения пистолетов-пулеметов послужила давняя тенденция тяготения винтовок...

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰)...



© cyberpedia.su 2017-2024 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав. Мы поможем в написании вашей работы!

0.009 с.