Эксперименты генома в деталях

Эксперимент 1 Ария и др. (Arya et al)

 

В этом эксперименте Aрия с коллегами описывают, как они получили «очищенный вирус» из «инфицированных» H9-клеток, а затем лизировали «частицы» для извлечения поли(А) РНК. Затем последняя была использована в качестве матрицы для синтеза комплементарной ДНК. Они писали: «Вирусные частицы были очищены от надосадочной жидкости HT-клеток, 9-ого клона (Н9), инфицированных Т-лимфотропным вирусом-III (HTLV-IIIB) [ВИЧ] путём центрифугирования через градиент плотности сахарозы при равновесии [полоса градиента плотности]». Из материала градиента плотности (этот материал Галло назвал «очищенные частицы вируса») они получили поли(А) РНК. Поли(А) РНК была обратно транскрибирована в комплементарную ДНК. По словам авторов, «Полученный полиаденилат [poly(А)], содержащий РНК, использовался в качестве матрицы для синтеза³² P-[радиоактивно] маркированных комплементарных ДНК (cДНК) в присутствии олиго(dT) праймеров. Размер получившейся в результате этого cДНК колебался от 0,1 до 10 kb (килобаза = тысяча нуклеотидов. Прим. переводчика) (не показан)».¹⁴

Интерпретация

Поли(А) РНК является геномом ретровируса.

Комментарии

Ария и др. сделали это утверждение, несмотря на то, что поли(А) РНК не является специфичной для ретровирусной. Они не опубликовали электронные микрофотографии, чтобы доказать, что материал градиента плотности («очищенный» вирус) состоял из вирусных частиц или любых частиц любого вида, очищенных или неочищенных. Кроме того, невозможно определить, каким образом «HTLV-III», используемый для заражения H9-клеток, был получен впервые. Различные отчёты приводятся в трёх разных документах, хотя Галло является соавтором всех из них:

(a) В статье Ария и др. авторы пишут: «HTLV-IIIB [ВИЧ] был первоначально получен из объединённых супернатантов кратковременных лимфоцитарных культур пациентовсо СПИДом» (выделено нами).

 

b) В статье, опубликованной в 1985 году, сообщено: «Клеточная линия H9/HTLV-IIIB была получена из человеческой Т-клеточной линии HT, после совместного культивирования с Т-лимфоцитами, полученными от нескольких больных СПИДом, и содержит много разных форм HTLV-III»¹⁸⁶ (выделено нами).

 

(с) Из майских статей 1984 года в журнале Science (где Галло заявил о доказательстве существования HTLV-III) складывается впечатление, что НТ-клеточные линии культивировали с концентрированными жидкостями (супернатантами), происходящими из ФГА-стимулированных Т-клеток культуры отдельных больных СПИДом. Однако через два года расследование, проведённое Управлением научной целостности (OSI) Национальных институтов здравоохранения в отношении предполагаемых научных проступков и лабораторных практик Галло, обнаружили, что HT-клеточная линия была культивирована с объединёнными культуральными жидкостями.^{109, 156, 187, 188}

Первоначально в состав смеси входили образцы из трёх, а, в конечном счёте, десяти пациентов.¹⁸⁷ Расследование в отношении Галло показало, что это «сомнительная научная строгость». Один учёный назвал процедуру «действительно сумасшедшей».¹⁵⁸

Неизвестный учёный говорит для многих. Ни один врач в течение всей жизни не планировал диагностировать пациента, например, с туберкулёзом лёгких или инфекцией мочевых путей, пытаясь изолировать бактерию из культуры мокроты или мочи пациента, смешанной с таковыми от девяти других пациентов.

Это особенно бессмысленный эксперимент в случае ретровирусов, потому что, как давно знают ретровирусологи, простое действие совместного культивирования может привести к появлению ретровирусоподобных частиц.^189,190

В доказательстве, полученном при расследовании OSI, Попович сказал, что он объединил супернатантные жидкости из десяти культур, потому что ни одна «индивидуально не вырабатывала высоких концентраций обратной транскриптазы».^{158, 191}

Важно отметить, что неспецифический фоновый уровень присущ методу Поповича по определению активности обратной транскриптазы и что этот уровень должен быть превышен, чтобы квалифицировать это как «высокие концентрации», когда Галло и его коллеги приняли решение доказать, что существует ретровирус. Однако, поскольку ни одна из десяти культур Поповича не вызывала таких «высоких концентраций», ни одна из них не была инфицирована ретровирусом. Нельзя создать ретровирус, манипулируя десятью источниками, где с самого начала нет ретровируса.

 

Эксперимент 2 Ария и др. (Arya et al)

В этом эксперименте поли(А) РНК были получены из (a) «ВИЧ-инфицированных»

Н9-клеток; (b) лейкемической клеточной линии; (c) HTLV-I и -II клеточных линий; (d) неинфицированных Н9-клеток. Затем эти РНК были исследованы с сДНК, полученной в первом эксперименте Арии с соавторами. Положительные сигналы гибридизации были обнаружены только при поли(А) РНК, полученных из «ВИЧ-инфицированных» клеток. Они обнаружили несколько «видов РНК около 9.0, 4.2 и 2.0 kb» и заключили, что «Эти полосы сходны по размерам с такими же, которые соответствуют геномному размеру мРНК(mRNA) и соединены с mРНК env и pХ последовательностями, ранее наблюдаемыми в клетках, инфицированных HTLV-I, в соответствии со связанностью этих вирусов».

 

Интерпретация

 

Поли(А) РНК, которая оседает в полосе 1,16 г/мл, представляет собой геном экзогенного ретровируса.

Комментарий

Поскольку нуклеиновые кислоты, используемые для получения зондов и для «инфицирования» клеточных линий, возникали в том же самом супернатанте, можно было бы ожидать положительной гибридизации с «инфицированными» клетками, даже если нуклеиновые кислоты были невирусными (см. ниже). Однако, если зонды были ретровирусными, можно было бы ожидать положительной гибридизации с неинфицированными H9-клетками.

Это связано с тем, что (а) ещё в 1983 году при исследовании ретровирусных последовательностей при лейкозах у человека, Галло показал, что HUT 78, предок H9-клеточной линии, «содержит провирусные последовательности HTLV» ¹⁵⁹ (b) в статье Арии и др. Галло и его коллеги «показали гибридизацией нуклеиновых кислот, что последовательности генома HTLV-III гомологичны структурным генам (gag, pol и env) как HTLV-I, так и HTLV-II и к потенциальной области кодирования под названием pX, расположенной между геном env и длинной терминальной повторяющейся последовательностью, которая уникальна для семейства ретровирусов HTL». Фактически, это утверждается в названии статьи Арии и др. «Гомология генома вируса, связанного со СПИДом, с геномами вирусов Т-клеточной лейкемии человека».

 

Эксперимент 3 Хан и др. (Hahn et al)

 

Хан, Галло и их коллеги заменили продукцию cДНК путём обратной транскрипции поли(а) РНК клонированием молекулярной [ДНК]. «Свежие неинфицированные Н9-клетки (8 X 109) были инфицированы концентрированным супернатантом от клеточной линии H9/HTLV-III содержащей 4x1011 частиц HTLV-III...Внехромосомные [цитоплазматические] ДНК были выделены...и проанализированы на содержание в ней в виде неинтегрированной вирусной ДНК с использованием сДНК HTLV-III в качестве зонда»¹⁵.

(Этот зонд сДНК ВИЧ был получен в эксперименте 1. Неинтегрированный относится к ДНК, не вставленной в ядерную ДНК). «Полоса из ~ 10 тысяч нуклеотидов (kb)» была обнаружена в гибридизации, из чего авторы пришли к выводу, эта «ДНК представляет собой линейную форму неинтегрированного HTLV-III [ВИЧ]. Когда они переварили неинтегрированную ДНК рестрикционными ферментами, она генерировала «три преобладающие полосы 9, 5.5 и 3.5 kb». Они «клонировали эту ДНК в библиотеку λ фага для скрининга с вирусной сДНК». Они получили три клона, λBH-10, λBH-5 и λBH-8, которые они интерпретировали как «λ BH5 плюс λ BH8, составляют один геном HTLV-III и λBH-10 другой... Однако вирусные фрагменты, клонированные в λ BH5 и λ BH8 могут быть получены из одного или двух разных вирусов» и являются«двумя вариантными формами HTLV-III в клеточной линии H9/HTLV-III». Они также заявили: «Используя эти клоны как зонды, мы также обнаружили HTLV-III -вирусные последовательности в инфицированных клеточных линиях, отличных от H9/HTLV-III, которые были установлены у разных больных СПИДом, а также в свежих некультивированных лимфоидных тканях больных СПИДом¹⁹». (Ссылка 19 - это третий документ о геноме ВИЧ, опубликованный Шоу (Shaw) и его коллегами¹⁶, см. ниже).

Интерпретация

«Эти данные свидетельствуют о том, что клонированные HTLV-III- геномы, представленные здесь, представляют собой вероятный этиологический вирусный агент СПИДа».

Комментарии

1. Согласно Хану и др., H9-клетки «были инфицированы концентрированным супернатантом из клеточных линий H9/HTLV-III, содержащих 4X1011 частиц HTLV-III». Никаких упоминаний и доказательств, представленных в каких-либо публикациях Галло, не было показано, каким образом было определено существование, число, морфология или чистота частиц.

2. В первой работе (эксперимент 2) сДНК использовали как зонд «инфицированных» и неинфицированных клеток. В работе Хана и др. были использованы три клона неинтегрированной ДНК с той же целью. Эти различия являются методологическими, и ни один из этих документов не доказывает, что ДНК - это ретровирус.

3. Даже если эти данные являются доказательством существования ретровирусного генома, они не доказывают, что вирус является экзогенным (см. выше), а тем более причиной СПИДа.

Эксперимент 4 (Шоу и др.)

В статье Шоу (Shaw) и др. ¹⁶ (ссылка 19 Хан) были повторены методы, используемые в публикации Хана и др. чтобы получить то, что, по их утверждению, было двумя ДНК-клонами интегрированного вирусного генома. То есть ДНК вставляется в ядерную ДНК как «провирус». Эти клоны были названы λHXB-2 и λHXB-3, а с 1984 года они обычно используются в геномных исследованиях ВИЧ, а также для диагностики и мониторинга ВИЧ-инфекции. «Чтобы определить, содержит ли геном HTLV-III последовательности, гомологичные нормальной человеческой ДНК», λHXB-2 использовали зонд инфицированной и неинфицированной клеточной ДНК HTLV-III. «Согласно стандартным условиям гибридизации... этот зонд гибридизован с ДНК из клеток H9/HTLV-III, а также и с другими инфицированными HTLV-III клетками, но не с ДНК из неинфицированных клеток H9 и неинфицированных HT-клеток (исходная клеточная линия, из которой клонировали H9) или не из нормальных тканей человека (данные не показаны)». Фактически, Шоу и его коллеги первыми использовали HXB-2 для диагностических целей. То есть для выявления предполагаемого ВИЧ-генома у больных СПИДом (см. ниже).

Интерпретация

«Этот вывод находится в согласии с результатами других экспериментов [сообщали в статье Хан и др. ], в которых интегрированная (репликативное промежуточное звено) форма HTLV-III была использована в качестве зонда и показывает, что HTLV-III, как и HTLV-I, и HTLV- является экзогенным ретровирусом, не имеющим нуклеиновых кислотных последовательностей, полученных из ДНК человека”.

Комментарии

Метод и результаты эксперимента ничем не отличаются от предыдущих экспериментов. При этом результаты этого эксперимента не доказывают, что вирус является экзогенным.

 

ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ ПО ГЕНОМНЫМ ЭКСПЕРИМЕНТАМ IN VITRO

Как Монтанье, так и Галло не использовали действительный контроль. Это упущение особенно важно, учитывая, что ретровирусные геномы присутствуют «во всех нас».⁴⁹

Поли(А) РНК и «ВИЧ-геном»

1. Все описанные выше эксперименты основаны на РНК, полученной из материала, называемого «очищенным вирусом». Тем не менее, как и повторяющаяся тошнота, «очищенный вирус» был не чем иным, как полосой градиента плотности сахарозы 1,16 г/мл. Кроме того:

(а) ни разу не было доказательств того, что материал полосы 1.16 г/мл, используемый в этих экспериментах, содержал ретровирусные частицы или частицы любого рода, чистые или нечистые;

(b) до 1997 года как Глушанков со своими коллегами, так и каждый исследователь по ВИЧ, включая Галло и его коллег, должны были знать, что «чистота вирусного препарата [не была] проверена». ¹⁶⁰

(с) давно известно, что полоса 1,16 /мл может содержать клеточную РНК, либо включённую (составную часть клеточных микропузырьков и обломков), либо не включённую (свободную). В 1975 году выдающийся ретровирусолог Джон Бадер (John Bader) писал: «К сожалению, клеточные компоненты также могут быть обнаружены в бэндинге плотности [ретро] вируса, особенно мембранных везикул, которые могут охватывать другие клеточные составляющие, включая нуклеиновые кислоты... [РНК и ДНК]. Нет опубликованных техник для преодоления излишних отягощений для очистки вирусов. Вместо документации обратного [и именно поэтому электронная микроскопия имеет решающее значение], следует предположить, что все образцы вирионов содержат загрязняющие клеточные элементы».⁷⁷ Два десятилетия спустя Бесс и др. подтвердили оговорки Бадера - «Микровезикулы [эта полоса при плотности ретровирусов 1,16 г/мл], как было установлено, содержат различные белки... и значительное количество РНК и ДНК», включая информационную (матричную) РНК, то есть поли(А) РНК.¹⁶²

 

2. Обоснование определения поли(А) РНК как ретровирусной ВИЧ-РНК было основано на работе, проделанной в 1972 году исследователями (включая Галло и его коллег) через год после открытия поли(А) РНК. Потому, что ретровирусная РНК была отнесена к типу поли(А) РНК, и на этом основании было заключено, что поли(А) РНК является диагностическим свойством ретровирусов.¹⁹² Однако, как обратная транскриптаза, так и ранее «связанный с ретровирусом» фермент АТФ (аденозинтрифосфат) ¹⁹³ поли(А) РНК не является ретровирусной специфичностью. В 1980 году такие данные были доступны всем ВИЧ-исследователям. Действительно, в обширной обзорной статье «История поли-А последовательностей: от формирования к факторам и к функции» (A history of poly A sequences: from formation to factors to function) Мэри Эдмондс (Mary Edmonds), обнаружившая фермент, который катализирует добавление поли(А)-хвостов к РНК, писала: «poly-A последовательности были обнаружены как в информационной РНК (mРНК), так и в их нуклеарных [клеточном ядре] предшественниках... поли(А последовательности обеспечивали основу для давно долгожданного пути для очистки mРНК... и генерации сДНК и зондов, полученных из них, от которых продолжают зависеть так много исследований экспрессии генов».¹⁹⁴

 

3. Если полоса плотности сахарозы, из которой возникла поли(А) РНК, содержала частицы «очищенного вируса», то полоса должна была состоять из поли(А) РНК и ни из какой другой РНК или ДНК. Не должно было быть необходимости в таргетинге (и извлечении) поли(А) РНК.

4. Во всех своих работах Галло и его коллеги неоднократно заявляли, что очищенные вирусные частицы были получены путём осаждения в «градиенте плотности сахарозы». Тем не менее, во время судебного разбирательства дела Парензе в 2006/2007 году Галло спросили, очистил ли ВИЧ Монтанье в 1983 году. Он ответил: «В этой статье, да, он сделал перекрёстный градиент (1,16 г/мл градиент плотности сахарозы). Я не знаю, говорил ли он, что вирус очищен. Если вы это не сделаете, у вас не будет много вируса».¹⁹⁵ Однако Галло и его сподвижники сделали именно это, и, по его собственным рассуждениям, он также«не имел большого количества вируса».¹⁹⁶

 

5. В феврале 2003 года в статье¹⁹⁷ в British были опубликованы интенсивные, 26-месячные, состоящие из 842 сообщений в режиме онлайн дебаты, которые были прекращены редактором в апреле 2005 года. http://www.bmj.com/content/326/7387/495/rapid-responses

 

В ходе этих дебатов мы провели несколько обменов мнениями с Брайаном Фоли (Brian Foley), хранителем базы данных по ВИЧ в Лос-Аламосе, который, в конечном итоге, согласился с тем, что:

 

(а) поли(А) РНК Галло в настоящее время считается геномом ВИЧ;

(b) поли(А) РНК не специфична для ретровирусов;

(c) поли(А) РНК получена из полосы плотности сахарозы 1,16 г/мл;

(d) не было доказательств, что полоса плотности 1,16 г/мл содержала очищенные ретровирусные частицы или любые другие ретровирусные частицы, чистые или нечистые.

 

Однако, Фоли всё ещё настаивал на том, что поли(А) РНК Галло является ВИЧ-геномом. Он основывал это утверждение на заявлении Галло о существовании инфекционного молекулярного клона ВИЧ. То есть, он утверждал, что есть опубликованные данные, показывающие, что введение этой РНК или её комплементарной ДНК в культуру клеток приводит к производству частиц ретровируса, имеющих те же морфологические особенности и составляющие, что и частицы «родительского вируса». Когда мы попросили доказательства существования такого инфекционного молекулярного клона ВИЧ, он ответил длинным списком статей. Хотя названия этих работ включали фразу «инфекционно-молекулярный клон», такие доказательства не могли быть найдены ни в одной из них. Все, что в них было, это доказательство клонирования ДНК, то есть получение ДНК из ДНК.

Мы задали Фоли следующий вопрос:

 

Правда ли, что под инфекционно-молекулярным клоном вируса подразумевается введение вирусного генома (молекулярного клона) в подходящие клетки, приводящие к появлению вирусных частиц, идентичных (как по внешнему виду, так и по составу) тем, из которых был получен геном? Да или нет?

Фоли согласился, что существует разница между клонированием фрагмента ДНК и инфекционно-молекулярным клоном. Он даже дал нам свое собственное определение последнего:

 

Да, как я уже говорил дважды или более раз. Клон должен производить вирусные частицы, идентичные по серологии, морфологии, по белковым последовательностям, RFLP (аббревиатура от restriction fragment length polymorphism. Примечание переводчика.) [ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционного фрагмента, в значительной степени устаревший метод профилирования ДНК], Саузерн-блоттинг и т. д. также идентичны родительскому вирусу, и частицы тоже должны быть инфекционными. Если клонированный вирусный геном не отвечает этим критериям, это не ИНФЕКЦИОННЫЙ молекулярный клон вируса, будь то ВИЧ-1 или любой другой вирус. Морфология с помощью электронной микроскопии является наименее важной из этих критериев, поскольку, как я уже неоднократно заявлял ранее, при электронной микроскопии все лентивирусы похожи. Кроме того, не всегда возможно обнаружить разницу между инфекционными и неинфекционными вирусными частицами с помощью электронной микроскопии.

На самом деле, невозможно доказать существование инфекционного молекулярного клона с использованием критериев Фоли. Чтобы доказать, что частицы одинаковы, требуется очистка не один раз, а дважды. В первый раз получить и охарактеризовать родительскую ретровирусную РНК, а второй - доказать, что РНК из «инфекционного молекулярного клона» идентична. Никогда не было доказательств очистки любых «ВИЧ»-частиц.

 

Затем мы попросили Фоли подтвердить существование ВИЧ-инфекционного молекулярного клона согласно его определению:

Брайан Фоли, пожалуйста, дайте нам исследование и несколько подтверждающих исследований, где доказано существование "инфекционного молекулярного ВИЧ-клона».

 

Если бы он этого не сделал, то, очевидно, у него не было бы выбора, кроме как признать, что существование ВИЧ-генома и, следовательно, ВИЧ-ретровирус остается недоказанным. Когда мы поняли, что Фоли не смог привести такое доказательство, мы написали:

Поэтому мы повторяем нашу просьбу: не мог бы Брайан Фоли дать нам резюме доказательств (а не только название) исследования, а также доказательств из нескольких подтверждающих исследований, где было доказано существование «инфекционного молекулярного клона» (как определено Брайаном Фоли) «ВИЧ-1».

Если Брайан Фоли не сможет ответить своими резюме и ссылками, то мы должны заключить, что весь его аргумент о существовании «ВИЧ-1», основанный на существовании «инфекционного молекулярного ВИЧ-1-клона», рушится.

 

Вместо того, чтобы дать нам доказательства, которые мы просили, согласно его собственным критериям, Брайан Фоли, Саймон Уэйн-Хобсон (Simon Wain-Hobson) и Джон Мур (John Moore) оказали давление на Ричарда Смита (Richard Smith), редактора British Medical Journal, чтобы остановить дебаты. Необъяснимо, но давление пришло не через British Medical Journal, а через Nature. ⁹³ Ответ Смита включал: «Как редактор BMJ, однако я нахожу тревожным видеть учёных, спорящих об ограничении свободы слова. Безусловно, открытое общение и аргументация - фундаментальная ценность науки…Мы никогда не должны забывать Галилея, поставленного перед инквизицией. Было бы ещё хуже, если бы мы позволили научной ортодоксальности стать инквизицией»¹⁹⁸. Вскоре после отставки Ричарда Смита в качестве главного редактора, редактор отдела писем BMJ Шэрон Дэвис (Sharon Davies),¹⁹⁹ прекратил дебаты. Своим вкладом в прекращение дебатов Фоли, Уэйн-Хобсон и Мур проигнорировали совет отца современной ретровирусологии, нобелевского лауреата покойного Говарда Темина (Howard Temin): «Когда эксперимент оспаривается независимо от того, кто его оспаривает, вы должны проверить его. Это железное правило науки, когда вы публикуете что-то, за что вы отвечаете за это... даже самый старший профессор... если его оспаривает самый низкий специалист или аспирант, он должен относиться к ним всерьёз и рассматривать их мнения... Это один из самых фундаментальных аспектов науки»²⁰⁰ (выделено в оригинале). В 2010 году BMJ опубликовал статью, авторы которой включают преемника Смита Фиона Годли (Fiona Godlee). По иронии судьбы документ заключил: «Авторы не хотят отвечать на критику своей работы... Редакторы должны обеспечить, чтобы авторы серьёзно относились к соответствующей критике и адекватно реагировали на нее».²⁰¹

Доказательства in vitro для экзогенной природы ВИЧ-генома

1. Так как нуклеиновые кислоты, присутствующие в том же супернатанте, были использованы для получения зондов (сДНК и его клонов) и для инфицирования H9 и других клеток, можно было бы ожидать положительной гибридизации с «инфицированными» клетками независимо от происхождения нуклеиновых кислот, вирусных или невирусных.

2. Галло и его коллеги утверждают, что клетки были инфицированы супернатантом, «содержащим 4X10¹¹ частиц HTLV-III». Не упоминается об объёме и, что более важно, о том, как они определили наличие «частиц 4X10¹¹» или даже любых частиц. Учитывая, что только за несколько месяцев до того, как электронный микроскопист Галло Мэтью Гонда (Mathew Gonda) столкнулся с проблемой обнаружения частиц в супернатанте инфицированных клеток, отсутствие электронных микроскопических данных является ключевым.¹⁵⁶

 

Факты:

1. У Галло никогда не было доказательств того, что «РНК HTLV-III» и, таким образом, сДНК и её клоны возникли в частицах с морфологией ретровирусных частиц, намного менее заразных ретровирусных частиц.

2. Поли(А) РНК не специфична для ретровирусов.

3. Полоса 1,16 г/мл, полученная центрифугированием градиента плотности неинфицированных супернатантов клеточной культуры, содержит поли(А) РНК, как показано Бессом и его коллегами.¹⁶²

4. Как уже упоминалось, независимо от её происхождения любая РНК или ДНК, присутствующие в супернатанте, могут быть взяты клетками и транскрибированы обратно.^183-185 Если ретровирусная ДНК может быть включена в клеточную ДНК, то нет никаких причин, по которым клеточная ДНК отсутствует, причина, почему то же самое не должно происходить ни с одной другой ДНК.¹⁰⁰

5. Обратная транскрипция не специфична для ретровируса.

6. В настоящее время принято считать, что в любой момент, когда можно найти новую ДНК в клетке, например, в Т-лимфоците, интерпретация заключается в том, что ДНК была введена извне. Однако, по словам Барбары МакКлинток (Barbara McClintock), геном может быть реструктурирован, и не только транспозицией (удаление и перенос ДНК-последовательности в другое место в геноме). В своей Нобелевской лекции 1983 года она сказала: «Быстрая реорганизация геномов может подчеркнуть некоторые виды образования. Наши нынешние знания предполагают, что эти реорганизации происходят от некоторого «шока», который заставлял геном реструктурировать сам себя, чтобы преодолеть угрозу его выживания... Большая геномная реструктуризация, безусловно, сопровождалась образованием новых видов».

«Геномный шок», который приводит к возникновению новых видов, может быть «вызван либо случайностями, происходящими внутри самой клетки, либо навязанными извне, такими как вирусные инфекции, разновидности скрещивания, яды различных видов или даже измененная среда, такая, как навязанная тканевой культурой» ²⁰²(выделено нами).

7. Доказательства, опубликованные с тех пор теми, кто находится в авангарде генетических исследований, подтверждают взгляды Макклинток. Это особенно относится к доказательствам, опубликованным учёными, участвующими в проекте генома человека, который был предпринят для составления карт генов человека и введения генетически основанной персонализированной медицины; в частности доказательства, собранные 300 учёными из 10 стран, участвующими в проекте «Энциклопедия ДНК-элементов» (ENCODE).^{203, 204} Целью ENCODE является «идентификация всех областей транскрипции, ассоциации факторов транскрипции, структуры хроматина и модификации гистонов в последовательности генома человека».²⁰³ По мнению исследователей ENCODE, невозможно сказать, где начинается и заканчивается транскрипция ДНК, то есть невозможно сказать, что такое ген.²⁰⁵ «Картина этих красок исследования - одна из невероятных сложностей. Вместо дискретных генов, добровольно продуцирующих идентичные транскрипты РНК, изобилующая масса транскрипции преобразует многие сегменты генома в несколько РНК-лент различной длины. Эти ленты могут быть получены из обеих нитей ДНК, а не из одной, как это принято считать... Мы пришли к осознанию того, что геном заполнен перекрывающимися транскриптами... простой взгляд на геном как имеющий определенный набор изолированных локусов, транскрибируемых независимо, не кажутся точными. Белки-кодирующие последовательности не имеют четкого начала или конца».²⁰⁶ Фактически, как отмечает Денис Нобл (Denis Noble), «некоторые учёные биологи даже отказались от использования слова «ген», за исключением кавычек».²⁰⁷ Более тридцати лет назад один из нас (ЭПЕ) предположил, что биологическая догма ошибочна и существует обратная связь между тремя полимерами, ДНК, РНК и белками, регулируемыми клеточной окислительно-восстановительной способностью и её колебаниями, в частности редокс пара миозин/актин.²⁰⁸

8. В настоящее время считается, что в любой момент, когда обнаруживается конкретная последовательность РНК в клетке, например Т-лимфоцит, если только РНК не вводится снаружи, все клетки, независимо от их физиологического состояния или стрессов, будут содержать соответствующий участок ДНК. Другими словами, ДНК (гены) в клетке является инвариантной, и все молекулы РНК в клетке сопровождаются соответствующей длиной ДНК. Это не тот случай. В 1980-х годах было обнаружено редактирование РНК. Это «широко определяется как процесс, который изменяет нуклеотидные последовательности молекулы РНК по сравнению с матрицей ДНК, кодирующей её». В этом случае нефункциональный транскрипт может быть перенастроен, продуцируя трансляционную mРНК или модифицировать уже функционирующую mРНК, чтобы она генерировала белок измененных аминокислотных последовательностей. Иногда редактирование настолько обширно, что большинство последовательностей в mРНК не кодируются геномным путем, а генерируются после транскрипции, создавая «парадоксальную ситуацию транскрипта, которая не обладает достаточной комплементарностью для гибридизации с её собственным геном!».^209-211 Недавно опубликованные данные свидетельствуют о том, что редактирование РНК играет значительную роль во многих клеточных и биологических явлениях и может быть вызвано химическим стрессом.^212-215

 

9. Никто иной, как Монтанье, соглашается с тем, что новые РНК могут возникнуть без участия экзогенных инфекционных агентов. В письменном свидетельстве от 2 февраля 2000 года в Комитет Палаты представителей США по правительственной реформе, подкомитет по национальной безопасности, делам ветеранов и международным отношениям в поддержку работы его коллеги Говарда Урновица (Howard B Urnovitz) (Монтанье входит в научно-консультативный совет публично торгуемой биомедицинской компании, директором которой является Урновиц), Монтанье писал: «Я рассмотрел опубликованные исследования доктора Урновица и показания, подготовленные для представления этому комитету, и настоятельно рекомендую, чтобы в будущих исследованиях по синдрому войны в Персидском заливе должно быть включено исследование обнаруженного генетического материала». Урновиц и его коллеги представили доказательства существования у ветеранов войны в Персидском заливе «новых», «невирусных» РНК, «возможно, вызванных воздействием экологических генотоксинов». Они пришли к выводу, что «закономерности появления RPA [полирибонуклеотидов] в сыворотках GWVs [ветеранов войны в Персидском заливе] и здорового контроля достаточно различны, чтобы предлагать возможные будущие диагностические применения... Наши исследования пациентов с активной множественной миеломой свидетельствуют о том, что у пациентов с индивидуальными хроническими многофакторными заболеваниями могут быть уникальные полирибонуклеотиды в их сыворотках. Проверенные тесты для таких предполагаемых суррогатных маркеров могут помочь в диагностике таких заболеваний или в оценке ответов на терапевтические методы».²¹⁶

10. Галло получил свою поли(А) РНК (ВИЧ-геном) из клеток, которые хранятся в культуре в течение длительного времени и подвергаются воздействию сильных окислителей («шоков»), включая PHA (фитогемагглютинин, ФГА). Он является окислителем, повсеместным в исследованиях в области ВИЧ и вызывает «как [резкое возрастание] уровня синтеза белков РНК, так и появление новой mРНК (поли(А) РНК).^{217, 218} Неудивительно, что в этих культурах предполагается найти «новые» mРНК («ВИЧ РНК»), которые не могут быть обнаружены в культурах, не подверженных аналогичному «стрессу». Поскольку зонды ПЦР-гибридизации исходят из этих культур, и поскольку пациенты со СПИДом и те, кто подвергается риску, подвергаются аналогичному окислительному стрессу, можно было бы предсказать, что у этих пациентов будет положительный тест ПЦР («вирусная нагрузка»²⁶), который ВИЧ-эксперты приписывают «ВИЧ-инфекции». Поскольку АРВ-препараты также являются окислителями^{65, 219-221}, то можно ожидать, что они будут вызывать дальнейшее редактирование РНК и модификации гистонов и хроматинов. Учитывая, что ПЦР-зонды исходят из культур, которые не подвергались дополнительному «стрессу» от АРВ-препаратов, можно было бы ожидать продуцирование РНК, которые не дополняют праймеры, применяемые на стадии амплификации в анализе «ВИЧ» РНК. Таким образом, «вирусная нагрузка» будет уменьшаться или даже стать не поддающейся обнаружению при лечении пациентов антиретровирусными препаратами.²²²

11. Будь «шок» Макклинток вызывающим «быструю реорганизацию геномов» или «многих сегментов» транскрипции ДНК или редактирование РНК, или комбинацией, включающей все эти три, всё равно открытие нового транскрипта РНК не доказывает существования непрерывной, комплементарной ДНК-последовательности в ядерной ДНК; или то, что РНК была введена в клетку извне.

Фактически, одна вещь, в которой были уверены авторы ENCODE, заключалась в том, что «Доступность хроматина и образцов (паттернов) модификации гистонов очень прогностичны, как при наличии и активности сайтов начала транскрипции, так и при времени репликации ДНК, коррелирующего со структурой хроматина». Поскольку регуляция гистонов и структура хроматина зависят от окислительно-восстановительного потенциала (редокса),^208,223,224 а ВИЧ-положительные и больные СПИДом имеют нарушения в клеточном редоксе (который происходит рано и является «массивным» согласно Монтанье²²⁵), ENCODE дает невирусологическое объяснение генерации не только оригинальной транскрипции РНК, но также и неудобного факта, что «бессимптомный пациент может содержать, по меньшей мере, 10⁶ генетически различных вариантов ВИЧ, а для больного СПИДом этот показатель превышает 10⁸».^{226, 227}

Но все утверждали, что это геном «уникального» ретровируса (см. ниже).

ВИЧ-ГЕНОМ IN VIVO

Кислотный тест на ВИЧ и ВИЧ-теория являются доказательством того, что ВИЧ-геном присутствует в Т4-клетках всех больных СПИДом. Все геномные данные in vivo были опубликованы Галло и его коллегами. Группа Монтанье не упоминала о попытках найти и охарактеризовать ВИЧ-геном у больных СПИДом.

 

Согласно Галло, гибридизация настолько чувствительна, что может обнаруживать ДНК в одном из миллиона клеток. Следовательно, поскольку:

1. Все люди с ВИЧ или СПИДом должны быть инфицированы ВИЧ (и, следовательно, иметь обнаруживаемую провирусную ВИЧ-ДНК);

2. По данным ВИЧ-экспертов Дэвида Хо⁸⁷ и Ксипинга Вэя⁸⁸, у ВИЧ-положительных людей наблюдается массовая ВИЧ-инфекция с самого начала и «Оценочная средняя общая продукция ВИЧ-1 составила10.3 x 10(9) [109] вирионов в день».²²⁸

Саузерн-блот-гибридизация должна быть более чем достаточной для его обнаружения.

 

Но обнаружение ДНК ВИЧ in vivo является проблематичным. Несмотря на то, что Хан др. утверждали, что Шоу и др. обнаружили ВИЧ-последовательности «в свежих некультивированных лимфоидных тканях больных СПИДом», в последней статье Галло и его коллеги могли бы сказать лучше: «... как показано здесь, ДНК HTLV-III [ВИЧ] обычно не обнаруживается стандартной гибридизацией Саузерн-блоттинга... когда это так, то полосы [сигналы] часто слабы... наблюдение, что последовательности HTLV-III встречаются редко, если вообще встречаются, в мононуклеарных клетках периферической крови, костном мозге и селезенке [клетках Т4 или анатомических сайтах, где расположены клетки Т4], даёт первое прямое доказательство того, что эти ткани не сильно или не широко инфицированы HTLV-III при СПИДе или при ARC (AIDS-related complex) [комплекс, связанный со СПИДом = неспецифическая продрома СПИДа]».¹⁶ Нахождение «слабого», «низкого сигнала» гибридизации было интерпретировано как «Это должно означать, что только незначительная популяция клеток заражается HTLV-III в любой момент времени» и «Теоретически эта низкая интенсивность сигнала также может быть объяснена наличием вируса, отдаленно гомологичного HTLV-III в этих клетках», HTLV-I или HTLV-II. Другими словами, Галло не смог доказать существование ВИЧ-генома у больных СПИДом.

 

В то время как Галло не смог доказать существование ВИЧ-генома у пациентов со СПИДом, другие сообщили о сигналах гибридизации ДНК «ВИЧ» в ситуациях, когда отсутствие ВИЧ-генома не оспаривается. Например:

 

1. Хотя больше не принимается, что «ВИЧ» передаётся насекомыми, в 1986 году несколько коллег Монтанье из Института Пастера с использованием Саузерн-блот-гибридизации обнаружили то, что они интерпретировали как последовательности ДНК ВИЧ в мухах цеце, чёрных жуках и муравьях в Заире и в Центральноафриканской Республике.²²⁹

2. В 1984 году Вайс и его коллеги сообщили о ретровирусе у двух молодых ВИЧ-отрицательных взрослых, страдавших общей вариабельной гипогаммаглобулинемией. Ретровирус «был явно связан с HTLV-III/LAV [ВИЧ]». Их доказательства включали Саузерн-блот-гибридизацию с использованием HXB-2 (HIV) от Галло как зонд.²³⁰

 

3. ДНК, выделенная из щитовидной железы у пяти ВИЧ-отрицательных пациентов с болезнью Грейвса (тиреотоксикоз), гибридизуется со «всей gag p24 кодирующей областью генома ВИЧ-1».²³¹

4. Хорвиц (Horwitz) и др., «Описывают первое сообщение о наличии нуклеотидных последовательн