Способы взят исслед.матердля микробиолог.исслед

Способы взят исслед.матердля микробиолог.исслед

Взят матер.дляисслед.

Для приготов препарата исслед матер берут из пробирки, колбы или чашки петрибактер петлей или стерильн пипеткой. Пробирку с бакт культурой берут в левую руку, а петлю за петледержатель- в правую. Петлю прожигают в пламени горелки до покраснения. Вращатдвиж вынимают из пробирки ватную пробку. Вводят петлю в пробирку,охлаждая ее о внутрпов-ть. Вынимают петлю из пробирки, жидкий материал из пробирки или колбы можно набирать пипеткой.,удерживая ее в прав руке и закрывая отверстие 2 пальцем

Приготовить мазок из исследуемого материала

1.чистка стекла

2.нанесение материала

3.размазывание материала на предметном стекле(мазок)

4.высушивание

5.фиксация

6.окрашивание

7.микроскопирование.

Высушивание. Высушивание мазка производится на воздухе. Для ускорения высушивания предметное стекло с мазком, обращенным кверху, подержать в струе теплого воздуха, высоко над пламенем спиртовки, не внося препарат в пламя.
Фиксация. Используют физический и химический методы фиксаций. Физический - фиксация мазка над пламенем горелки или спиртовки в течение нескольких секунд мазком вверх. Эту операцию проводят достаточно быстро, стараясь не перегреть мазок так как при перегревании могут произойти необратимые изменения в клетке. Химический метод фиксации - более мягкий по сравнению с фиксацией на пламени. В качестве фиксаторов используют этанол, ацетон, смесь Никифорова (этанол + эфир 1:1), метанол, фйрмалин. После фиксации мазок можно окрашивать.
Окраска мазка. На мазок нанести несколько капель раствора красителя так, чтобы весь мазок был покрыт краской. Оставить краску на определенное время. Промыть препарат водой, просушить фильтровальной бумагой.
Рассматривать препарат с использованием иммерсионной системы. Каплю иммерсионного масла можно наносить только на сухой мазок.
Отношение микроорганизмов к красящим веществам называется тинкториальным свойством. Наибольшее применение имеют основные краски: метиленовый синий, основной фуксин, генцианвиолет, кристаллический фиолетовый и другие.
Окраска микроорганизмов имеет большое диагностическое значение, так как дает возможность установить морфологические и тинкториальные особенности микроба. В некоторых случаях этого достаточно для постановки микробиологического диагноза.
Окраска микроорганизмов представляет собой сложный физико-химический процесс, в механизме которого существенную роль играют явления адсорбции, капиллярности, химического сродства между красителем и окрашиваемым объектом и рН среды, в которой они находятся.
Различают простые и сложные методы окраски
К простым относятся методы с использованием одного вида красителя, к сложным - нескольких красителей.
Простые методы окраски: метиленовым синим - окраска в течение 3-5 мин;
генцнанвиолетом - окраска в течение 1 -2 мин;
фуксином водным - окраска в течение 1-2 мин.
Простыми методами окраски пользуются для обнаружения в микроскопируемом материале микробов, определения их количества, формы и расположения.
Сложные методы окраски используют для дифференциации микробов по морфологическим и тинкториальным свойствам.

 

Работа с микроскопом

1. Микроскоп поставьте штативом к себе на расстоянии 5-10 см от края стола. Приведите микроскоп в рабочее положение, наклонив верхнюю часть штатива на 45 градусов. В отверстие предметного столика при помощи зеркала направьте свет.

2. Приготовленный препарат поместите на предметный столик и закрепите предметное стекло зажимами.

3. Пользуясь винтом, плавно опустите тубус так, чтобы нижний край объектива оказался на расстоянии 1-2 мм от препарата.

4. В окуляр смотрите одним глазом, не закрывая и не зажмуривая другой. Глядя в окуляр, при помощи винтов медленно поднимайте тубус, пока не появится чёткое изображение объекта исследования.

5. После работы микроскоп приведите в нерабочее положение и уберите в футляр.

Микроскоп - хрупкий и дорогой прибор: работать с ним надо аккуратно, строго следуя правилам.

 

Механизм окраски по ГРАМу

1. На фиксированный мазок нанести генцианвиолет (бумага по Синеву) на 1-2 мин

2. Краску слить и нанести раствор Люголя на 1 мин

3. Раствор Люголя слить и на мазок нанести 96% спирт на 15-20 мин в зависимости от толщины мазка

4. Спирт смыть дистиллированной водой

5. Мазок дополнительно окрасить разведенным фуксином Пфейффера на 2-3 мин

6. Краситель смыть водой, препарат высушить, промикроскопировать с иммерсией

7. Микроскопия с иммерсией.

Грамположительные (Гр+) бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные (Гр-) бактерии окрашиваются в красный цвет.

4.Принцип работы темнопольной и фазово-контрастной микроскопии
При работе по методу темного поля, препарат освещается полым световым конусом, апертура которого больше, чем апертура объектива, таким образом, входной зрачок микрообъектива оказывается в области геометрической тени и прошедший без преломления свет не попадает в объектив. В оптической микроскопиитёмного поля неоднородности образца рассеивают свет, и этот рассеянный свет формирует изображение исследуемого образца.

Особенностью микроскопа темного поля является способ освещения образца, который осуществляется «сбоку» (зеленая полоса на рисунке). При таком освещении неоднородности, имеющиеся в образце, рассеивают падающий свет и в микроскопе изображение образца наблюдают в рассеянном свете, а «освещающий» световой пучок не попадает в объектив. Такое освещение называется эпи-подсветкой (EPI-illuminator, EPI—microscope, EPI-objectivelens).

Для прозрачных объектов возможно и контровое освещение, но при этом необходимы дополнительные действия, чтобы убрать «прямое поле»: необходимо провести фурье-преобразование полученного изображения и удалить из полученной суммы компоненту, соответствующую «опорной» волне. Это можно сделать, например, с помощью линзы и шаблона, закрывающего небольшой участок в плоскости, где линзой фокусируется «опорная» световая волна. Затем, с помощью второй линзы проводят обратное преобразование Фурье и наблюдают полученную картину визуально. При этом контраст исходного изображения существенно возрастает.

В микроскопах использование метода тёмного поля может быть предусмотрено конструкцией^[2] или реализуется установкой дополнительных узлов, таких, как конденсор темного поля ОИ-13.

Микроскопировани е -способ исследования микрообъектов.

· Для изучения неокрашенных объектов используется фазово-контрастное устройство, с помощью которого можно получить четкое контрастное изображение прозрачных, не имеющих окраски микроорганизмов.

 

Для получения фазовоконтрастного изображения свет от источника разбивается на два когерентных световых луча, один из них называют опорным, другой предметным, которые проходят разные оптические пути. Микроскоп юстируют таким образом, чтобы в фокальной плоскости, где формируется изображение, интерференция между этими двумя лучами гасила бы их.

 

Изображение клетки в фазово-контрастном микроскопе

Длину оптического пути изменяют с помощью так называемой фазовой пластинки (англ.)русск., расположенной на фазовом кольце. Когда на пути одного из лучей находится образец, преломление света в нём изменяет оптический путь, а, следовательно, и фазу, что изменяет условия интерференции.

Фазово-контрастная микроскопия особенно популярна в биологии, поскольку не требует предварительного окрашивания клетки, из-за которого та может погибнуть.

ОКРАСКА ПО МЕТОДУ ОЖЕШКО

1. На высушенный мазок (нефиксированный!) + несколько капель 0,5% НCl, держать над пламенем спиртовки до образования паров

2. Высушивают и фиксируют физическим способом

3. Окрашивают по методу Циля-Нильсена:

1) На фиксированный препарат + фильтровальная бумага + фуксин Циля. Подогреваем до отхождения паров + краситель (2 раза)

2) Н₂О

3) 5% Н₂SО₄ (погружая 2-3 раза)

4) Н₂О

5) Метиленовый синий 1 % - 3-5 мин

6) Н₂О

4. Микроскопия с иммерсией

 

Метод Ожешко сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ВИСЯЧЕЙ КАПЛИ

4. Для приготовления препарата необходимы стекло с лункой, покровное стекло, вазелин. Края лунки покрывают тонким слоем вазелина

5. На покровное стекло наносят каплю культуры и осторожно накрывают покровное стекло стеклом с лункой так, чтобы капля оказалась в центре

6. Склеившиеся стекла быстро переворачивают покровным стеклом вверх. Капля находится в герметической камере и сохраняется долгое время

 

МЕТОД РАЗДАВЛЕННОЙ КАПЛИ

4. На предметное стекло наносят пипеткой или петлей каплю культуры и покрывают ее покровным стеклом.! Чтобы не образовалось пузырьков воздуха, покровное стекло подводят ребром к краю капли и резко опускают его

5. Для предохранения от высыхания препарат помещают во влажную камеру

6. Микроскопируют в темном поле при увеличении объектива 40Х

Препарат можно поместить во влажную камеру для предохранения от высыхания

 

10. Существующие на настоящее время приказы и инструкции не запрещают кипячение как метод стерилизации хирургического инструментария. Хотя он не гарантирует их полного обеспложивания. Установлено, что при кипячении в 100°С происходит сворачивание белка, и большинство бактерий погибает, но, например, споры почвенного термофила выдержиают кипячение в течение 500 мин. Длительное кипячение выдерживают также споры столбняка, вирусы гепатита. Бактерии, укрытые землей, кровью, эксудатом, выдерживают кипячение неопределенно длительное время. Для стерилизации инструментария кипячением используются стационарные или переносные кипятильники (старое название — стерилизаторы). Перед кипячением в воду добавляется гидрокарбонат натрия до образования его 2% раствора. Длительность кипячения составляет 30 мин от момента закипания.

 

11. На настоящее время наиболее надежным методом стерилизации хирургического инструментария является стерилизация горячим воздухом (сухим жаром). Этим методом можно стерилизовать металлические, фарфоровые, стеклянные инструменты. При стерилизации изделий из синтетики, бумаги, текстиля, дерева они могут подвергаться обугливанию. Для стерилизации используются самые разные марки и типы воздушных стерилизаторов (старое название — сухожаровые шкафы) с электронной регуляцией и контролем времени и режима стерилизации. Стерилизация производится при 180°С в течение 60 мин.

 

12.Автоклавирование
Стерилизация - метод, обеспечивающий гибель в стерилизуемом материале вегетативных и споровых форм патогенных и непатогенных микроорганизмов.

Стерилизация, паровой метод (автоклавирование).
Надлежащая стерилизация в автоклаве возможна при строгом соблюдении правил подготовки биксов и их загрузки соответствующими изделиями, для чего следует:
• обработать внутреннюю поверхность бикса 70% спиртом и на его дно положить простыню с таким расчетом, чтобы затем ее концами накрыть содержимое бикса;
• заложить в бикс наборы резиновых изделий, перевязочного материала, белья;
• инструменты завернуть в полотенце или пеленку и заложить в бикс;
• после загрузки бикса разместить в нем 5 индикаторов: 4 - по внутренней стороне стенок бикса и 1 - в центре бикса (непрямой метод контроля стерильности);
• на крышке бикса зафиксировать бирку, на которой отметить: вид материала и лечебное отделение, для которого производится стерилизация инструментов и материалов;
• крышку бикса герметично закрыть. У бикса старого образца сдвинуть металлическую ленту-пояс и тем самым открыть окна на его стенках, которые после завершения стерилизации необходимо закрывать;
• после стерилизации на бирке бикса поставить дату и подпись медицинской сестры, проводящей

автоклавирование.
Возможны различные варианты комплектации биксов: только один вид материала, наборы для типичного или конкретного оперативного вмешательства.

Стерильность материалов, изделий, сроки сохранения:
• закрытые биксы старого образца – 72 часа;
• закрытые биксы нового образца – 20 суток;
• при открытом биксе любого образца стерильность материалов, изделий сохраняется до 24 часов;
• крафт-пакеты, заклеенные – 20 суток;
• крафт пакеты на скрепках – 3 суток.
При открытом крафт-пакете материалы и изделия должны быть использованы сразу.

 

13. Пастеризация — процесс одноразового нагревания чаще всего жидких продуктов или веществ до 60 °C в течение 60 минут или при температуре 70—80 °C в течение 30 мин^[1]. Технология была предложена в середине XIX века французским микробиологом Луи Пастером. Применяется для обеззараживания пищевых продуктов, а также для продления срока их хранения

14.Кварцевание — процесс обработки (обеззараживания) помещения (воздуха) ультрафиолетовым излучениемкварцевой лампы.В результате кварцевания воздух обогащается озоном, который, в свою очередь, также дезинфицирует воздух. Озон ядовит, поэтому после кварцевания помещение следует проветривать.

15.Дезинфектант – это химический препарат, используемый человеком для уничтожения микроорганизмов и поддержания санитарно-гигиенических норм. Новые дезинфицирующие вещества разрабатываются на основе таких традиционных групп химических соединений, как спирты, альдегиды, фенолы, перекиси, ПАВ и хлорсодержащие вещества. Кроме того, постоянно разрабатывается возможность их соединения для создания композитного дезинфицирующего средства.

16.Асептика — комплекс мероприятий, направленных на предупреждение попадания микробов в рану.

Антисептика (лат. anti — против, septicus — гниение) — система мероприятий, направленных на уничтожение микроорганизмов в ране, патологическом очаге, органах и тканях, а также в организме больного в целом, использующая механические и физические методы воздействия, активные химические вещества и биологические факторы.

Реакция агглютинации

Реакция агглютинации представляет собой процесс склеивание и выпадение в осадок корпускулярного антигена (агглютиногена) под воздействием специфических антител (агглютининов) в растворе электролита в виде глыбокагглютината.

РА протекает в две фазы. Первая - специфическая (невидимая) - взаимодействие антител с антигеном, вторая - неспецифическая (видимая) - выпадение глыбокагглютината.

 

18. Реакция преципитации (РП) - это формирова­ние и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количес­твах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.
Механизм. Проводится с прозрачными коллоид­ными растворимыми антигенами, экстрагированными из патоло­гического материала, объектов внешней среды или чистых культур бактерий. В реакции используют прозрачные диагности­ческие преципитирующие сыворотки с высокими титрами анти­тел. За титр преципитирующей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии с иммун­ной сывороткой вызывает образование видимого преципитата — помутнение.

2-приготовление мазка из исследуемого материала

приготовить мазок из исследуемого материала

Техника приготовления мазков определяется характером исследуемого материала. 1. Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной среды и из жидкого патологического материала (моча, лик-вор и др.). Маленькую каплю исследуемой жидкости наносят бактериальной петлей на предметное стекло и круговыми движениями петли распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром в копеечную монету. 2. Приготовление мазков из крови. На предметное стекло, ближе к одному из его концов, наносят каплю крови.

Второе — шлифованное — стекло, которое должно быть уже предметного, ставят на первое под углом 45° и подводят к капле крови до соприкосновения с ней. После того как кровь растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно распределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла (рис. 3). Толщин-а мазка зависит от величины угла между стеклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. Правильно-приготовленный мазок имеет светло-розовую окраску и одинаковую толщину на всем протяжении. 3. Приготовление толстой капли. На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают стекло непосредственно к капле крови, выступающей из пальца.

Нанесенную на стекло кровь размазывают бактериальной петлей так, чтобы диаметр образующегося мазка соответствовал величине копеечной монеты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до подсыхания крови. Кровь в «толстой капле» распределяется неравномерно, образуя неровный край. 4. Приготовление мазка из вязкого материала (мокрота, гной). Мокроту или гной, нанесенные на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг к другу., После этого свободные концы стекол захватывают I и II пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу. Получаются мазки с равномерно распределенным материалом, занимающим большую часть.

Выделение чистой культуры

При бактериологическом методе в анаэростат помещают посевы анаэробов. Из аэростата удаляют воздух и заменяют его газовой смесью, которая не содержит кислород.

Основой бактериологического метода является выделение чистой культуры возбудителя, которое происходит на первом этапе исследования. Для выделения чистой культуры возбудителя делают посев взятого материала. Посев делается, как правило, на плотные питательные среды, которые выбирают исходя из свойств предполагаемого возбудителя.

При бактериологическом методе применяют по возможности среды, на которых растет только конкретный вид бактерий — элективные среды, или среды, позволяющие отличить предполагаемого возбудителя от других микроорганизмов или по-другому дифференциально-диагностические среды.

Например, при бактериологической диагностике кишечных инфекций – среду Эндо, для выделения дифтерийной палочки используют теллуритовые среды, и т. д. При выделении условно-патогенных микроорганизмов при бактериологическом методе посев взятого материала осуществляют на универсальные питательные среды. Примером такой среды может служить кровяной агар.

Все манипуляции, которые связанны с выделением бактериальных культур, проводятся над пламенем горелки.

При выделении из патологического материала чистой культуры возбудителя, который существенно загрязнен посторонней микрофлорой, часто пользуются биологическим методом выделения чистой культуры. Делают это следующим образом: заражают исследуемым материалом чувствительных к возбудителю лабораторных животных. Еще один пример биологического метода – при исследовании больного на содержание в мокроте пневмококков, материал внутрибрюшинно вводят белым мышам. Из их крови через 4-6 часов получают чистую культуру пневмококка.

4)приготовление мазка с помощью импрессионной системы

На предметное стекло, при помощи бактериальной петли, нанести мазок. Высушить его на воздухе, а затем зафиксировать в пламени спиртовки. Мазок должен быть равномерно растертым и не густым. Фиксированный мазок – носит название ПРЕПАРАТ (5 баллов).

2. Приступить к окраске по Граму (5 баллов).

Этап 1: на препарат нанести несколько капель раствора генцианвиолета. Окрашивать 1 – 2 минуты. Слить остатки красителя.

Этап 2: не промывая водой, нанести раствор Люголя до почернения
(1 мин.), затем раствор слить.

Этап 3: не промывая водой, нанести 96% спирт до отхождения красителя (30-60 с).

Этап 4: промыть препарат водой. Э тап 5: докрасить фуксином 3 мин, промыть водой и высушить.

3. Микроскопировать окрашенный препарат при помощи иммерсионной системы светового микроскопа. По результатам окрашивания грамположительные микроорганизмы окрасятся в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные в розово-малиновый. Внимание! Приготовленный и окрашенный препарат продемонстрируйте преподавателю! (5 баллов).

4. Зарисовать увиденные в поле зрения микроскопа объекты в отведенное для этого поле справа на бланке работы (3 балла).

5. Сравнить полученный рисунок с изображениями основных форм бактерий (см. приложение 1). Определить родовую принадлежность исследованного микроорганизма и предположить его видовое название (2 балла).

Способы взят исслед.матердля микробиолог.исслед

Взят матер.дляисслед.

Для приготов препарата исслед матер берут из пробирки, колбы или чашки петрибактер петлей или стерильн пипеткой. Пробирку с бакт культурой берут в левую руку, а петлю за петледержатель- в правую. Петлю прожигают в пламени горелки до покраснения. Вращатдвиж вынимают из пробирки ватную пробку. Вводят петлю в пробирку,охлаждая ее о внутрпов-ть. Вынимают петлю из пробирки, жидкий материал из пробирки или колбы можно набирать пипеткой.,удерживая ее в прав руке и закрывая отверстие 2 пальцем