Качественные реакции на белки

Качественные реакции на белки

Методы качественного обнаружения белков основаны на двух типах реакций: а) по пептидным связям белковой молекулы; б) по аминокислотным радикалам ее. Примером реакции первого типа служит биуретовая реакция. Примером реакций второго типа являются многочисленные цветные реакции на радикалы аминокислот (реакция Сакагучи — с α-нафтолом, реакция Паули - с нитритом калия, реакция Циммермана — с о-фталевым диальдегидом, нингидриновая реакция и др.)

 

Биуретовая реакция.

К 1-2 мл раствора белка прибавляют двойной объем 30%-ного раствора гидроксида натрия и хорошо перемешивают. Затем из капельницы добавляют несколько капель 1%-ного раствора сульфата меди и снова хорошо перемешивают. Развивается интенсивное красно - фиолетовое окрашивание, свидетельствующее о наличии пептидных, т.е. -СО-NH-, связей в молекуле белка. При малом содержании белка чувствительность реакции можно повысить, наслаивая на раствор белка в щелочи 1 мл 1%-ного раствора сульфата меди. При стоянии на границе двух слоев появляется фиолетовое кольцо.

Для сравнения проводят ту же реакцию с биуретом, который легко может быть получен при нагревании мочевины:

 

2 H₂N-CO-NH₂ → +t → NH₃ + H₂N-CO-NH-CO-NH₂

мочевина биурет

 

Для этого несколько кристаллов мочевины помещают в пробирку и осторожно прокаливают в пламени газовой горелки. По охлаждении приливают в пробирку 10%-ный раствор гидроксида натрия и добавляют несколько капель 1%-ного раствора сульфата меди. После перемешивания развивается сине-фиолетовая окраска.

И в том, и в другом случае окраска вызвана образованием комплексного соединения:

 

Биурет в щелочной среде претерпевает полную енолизацию по схеме:

Две молекулы диенольной формы биурета взаимодействуют с гидроксидом меди (II) и образуют комплексное соединение, в котором координационные связи образованы за счет электронных пар атомов азота иминных групп.

Аналогично построено комплексное соединение меди с енолизированными пептидными группами полипептида.

 

 

Комплексы такого типа обладают преимущественно красной окраской (максимум поглощения в пределах 520-530 нм). В случае образования медных комплексов при участии трех или двух атомов азота окраска их преимущественно фиолетовая и синяя (с максимумами поглощения в пределах 540-580 нм и 615-670 нм соответственно). Поэтому окраска растворов при проведении биуретовой реакции варьирирует от синей до красной с преобладанием фиолетовой.

 

Нингидриновая реакция

К 1-2 мл разбавленного раствора белка приливают 3-4 капли 1%-ного раствора нингидрина в 95%-ном растворе ацетона. Раствор перемешивают и ставят в водяную баню при 70°С на несколько минут. Развивается сине-фиолетовое окрашивание.

Эта реакция обнаруживает в растворе α-аминокислоты. Сначала в результате взаимодействия аминокислоты с нингидрином возникает Шиффово основание. Затем оно претерпевает перегруппировку, декарбоксилируется и расщепляется на альдегид и аминодикетогидринден.

Аминодикетогидринден конденсируется еще с одной молекулой нингидрина, и образовавшееся соединение, енолизируясь, переходит в окрашенную форму, получившую название «сине-фиолетовый Руэмана», по имени исследователя, впервые в 1910 г. изучившего эту реакцию.

 

Ксантопротеиновая реакция.

К 1 мл раствора белка добавляют 5-6 капель концентрированной азотной кислоты до появления белого осадка или мути от свернувшегося белка. При нагревании раствор и осадок окрашиваются в ярко-желтый цвет. При этом осадок почти полностью растворяется. Охлаждают смесь и осторожно добавляют к раствору, имеющему кислую реакцию, не взбалтывая, по каплям избыток концентрированного раствора аммиака или щелочи до щелочной реакции. Выпадающий вначале осадок кислотного альбумината растворяется, и жидкость окрашивается в ярко-оранжевый цвет.

Ксантопротеиновая реакция происходит только при наличии в белках остатков ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана). Желатина, например, не содержит ароматических аминокислот и поэтому она не дает ксантопротеиновой реакции. В результате реакции нитрования по радикалам ароматических аминокислот образуются желтоокрашенные нитросоединения. Изменение желтой окраски в оранжевую в щелочной среде обусловлено появлением хромофорной группы.

 

 

Реакция Сакагучи.

Берут в пробирку 2-3 мл разбавленного раствора белка, добавляют 1 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия и вслед за этим несколько капель 0,2%-ного спиртового раствора α-нафтола. Перемешивают, приливают 0,5 мл раствора гипобромида натрия и вновь перемешивают. Развивается оранжево-красное окрашивание. Появление окраски объясняется взаимодействием α-нафтола в присутствии окислителя с гуанидиновыми группировками радикалов аргинина, имеющимся в молекуле белка.

 

Нитропруссидная реакция.

К 3 мл разбавленного белка приливают равный объем насыщенного раствора сульфата аммония 2-3 капли 5%-ного раствора нитропруссида натрия. Затем раствор подщелачивают несколькими каплями крепкого раствора аммиака. Если в белке присутствует цистеин, то происходит реакция, в результате которой развивается пурпурное окрашивание.

 

Реакция Паули.

К 1 мл 1%-ного раствора сульфаниловой кислоты в 0,5%-ном растворе соляной кислоты приливают 2 мл 0,5%-ного раствора нитрита натрия, сильно встряхивают и немедленно добавляют сначала 2 мл разбавленного раствора белка, а затем, после перемешивания содержимого пробирки, 6 мл 10%-ного раствора карбоната натрия. После смешивания растворов развивается вишнево-красное окрашивание.

Возникновение окраски обусловлено наличием в белковой молекуле остатков гистидина и тирозина.

 

Реакция Троммера

Моносахариды в щелочной среде восстанавливают гидроксид меди (II) до гидроксида меди(I), окисляясь при этом до альдоновых кислот.

В пробирку наливают 1-2 мл раствора глюкозы и равный объем 10%-ного раствора гидроксида натрия. К смеси прибавляют при встряхивании по каплям 5%-ный раствор сульфата меди(II) до появления неисчезающей мути. Осторожно нагревают верхнюю часть содержимого пробирки. Появляется желтое окрашивание (гидроксид меди(I)), переходящее в оранжево-красное (оксид меди (I)), что указывает на положительную реакцию Троммера.

 

Методы выделения жиров.

Обычно липиды извлекают из высушенных (обезвоженных) тканей соответствующими органическими растворителями (спирты, эфиры, бензол, толуол, бензин, ацетон, пиридин, хлороформ, четыреххлористый углерод, сероуглерод, петролейный эфир и др.). Для разделения липидов пользуются неодинаковой растворимостью их в различных растворителях: одни из них хорошо растворимы в эфире, но плохо в ацетоне (например, фосфолипиды), другие растворимы в бензоле, но не растворимы в спирте (холестерол, цереброзиды) и т.д. Резервный жир (масло) извлекается легко. Извлечь связанные липиды можно лишь после разрушения белково-липидных комплексов. Липиды из связанного состояния в свободное переводят либо путем применения гидролизующих средств, либо путем предварительного кипячения материала со спиртом. В последнем случае липиды выделяются в неизменном виде.

Наиболее простым методом определения суммарных липидов в тканях является метод длительного настаивания навесок ткани в хлороформ - метанольной смеси. По разности масс образца до и после экстракции находят процентное содержание липидов.

При выделении липидов из биологического материала происходит их окисление и деградация, приводящие к образованию побочных продуктов. Поэтому выделение липидов надо проводить быстро, в условиях, максимально исключающих влияние таких факторов, как повышенная температура, кислород воздуха, свет, загрязнение следами металлов и т.д.

Для экстракции используют смесь метанола и хлороформа, которая разрушает липопротеидные комплексы и тем самым дает возможность достаточно полно извлечь липиды.

Реакция с иодной водой

При добавлении к раствору, содержащему витамин С, 0,1%-ного раствора I₂ в KI наблюдается обесцвечивание иодной воды.

 

Количественное определение аскорбиновой кислоты в исследуемом материале осуществляют с помощью 2,6-дихлорфенолиндофенола, используя его титрованный раствор. По количеству реактива, израсходованного на окисление витамина С, определяют содержание последнего в анализируемом материале.

Известна методика количественной оценки аскорбиновой кислоты по результатам титрования исследуемого раствора стандартным раствором иода в присутствии серной кислоты.

Практикум

Утка

1. Определение ненасыщенных жиров.

К 3 г утиного жира добавляют 3-4 мл органического растворителя (ацетон, хлороформ, диэтиловый эфир, петролейный эфир и др.). После тщательного перемешивания раствор декантируют и добавляют по каплям бромную воду. Первые капли бромной воды тут же обесцвечиваются.

2. Определение белка.

Проводят ксантопротеиновую реакцию. На кусок утиного мяса капают каплю концентрированной азотной кислоты. В течение 1-2 минут появляется характерное желтое окрашивание.

 

Яблоки

1. Определение железа

2. Проверка спелости (по реакции с иодом – нет синего окрашивания крахмала) весь ли крахмал перешел в сахар

3. + иодная вода _ обесцвечивание; аскорбинка

4. рН -?

 

Творог

1. Обнаружение кальция в твороге

2. Обнаружение молочной кислоты

3. Обнаружение казеина

 

Капуста

1. Определение витамина С

2. Определение в капусте сахаров (в молодой и осенней – сравнить

 

Мед

1. Определение фруктового и виноградного сахара в меде.

 

Морепродукты

1. Определение полиненасыщенных жирных кислот в мясе гребешков

2. Определение цинка в гребешках

 

«С» восстанавливает 2,6-дихлорфенолиндофенол, который в Н⁺ – красная окраска, а при восстановлении обесцвечивается в ОН- - синяя окраска

титруют в Н+ щелочным раствором 2,6-дихлорфенолиндофенол до появления розового окрашивания

Реакция Селиванова на фруктозу

Сух. Резорцин + 2капли НСl + 2 капли 0,5%-го раствора фруктозы и нагревать до начала кипения. Из желтого в красное окрашивание

 

 

Картошка

1. Определение крахмала в картошке

2. Определение водорастворимых белков по Лоури

3. Определение алкалоида соланина (кач. цв. р-ция)

 

Рыба

1. Определение полиненасыщенных жирных кислот в жире рыбы

2. Определение иода в морской рыбе

 

Морковка-свекла

1. Определение каротина в морковке

2. Определение бетаина в свекле

3. Выделение бетаина из свеклы

 

Хлеб

1. Определение крахмала

 

Масло

1. Масло — эмульсия жира в воде. Можно ли разрушить ее, расслоить химическим способом?

2. Белки в сливочном масле?

3. Ненасыщенные жирные кислоты?

 

Имбирь

1. Извлечение эфирного масла из имбиря и определение терпенов

2. Определение общей антиоксидантной активности (вытяжки из него)

3. Определение кетонов

 

Орехи

1. Экстракция масел из орехов

2. Присутствие фенола в скорлупе кешью

 

Сыр

1. Определение белка, аминокислот

2. Определение жира

 

Ананас

1. Определение аскорбинки в ананасе

2. Определение железа и фосфора?

3. Сахара -13%

 

Курица

1. белки

 

Соль

1. Осмос. Три кубика картошки в а) воде; б) крепком соленом растворе; в) в изотоническом растворе.

2. температура воды; воды с солью, вода сольдом и солью

3. отмыть чашку, закоричневевшую от заварки горстью соли

 

Клюква-брусника

1. Определение бензойной кислоты

2. определение кислот вообще

3. определение пектиновые вещества

 

Утка

1. Определение белка

2. Определение жиров

3. Определение железа в мясе

 

Кофе

1. Определение кофеина

 

Яблоки

1. Определение спелости яблока по иодкрахмальной пробе

2. Определение железа

3. Определение суммарной антиоксидантной активности

4. Определение растворимых пектиновые

 

Кокос

1. Извлечение кокосового масла из мякоти кокоса

2. Определение суммарного минерального состава кокосового молока

 

Гранат

1. Определение лимонной кислоты

2. Определение железа

3. Определение суммарного минерального состава

 

Рис

1. Определение крахмала в сыром рисе и рисовом отваре.

 

Грецкие орехи

1. выделение масла из ядра грецкого ореха

 

Авокадо

1. Определение ненасыщенных жирных кислот

 

Чеснок

1. Определение антиоксидантной способности чеснока (витамин С)

 

В незрелом яблоке.

Соке морковки, шпинате.

Определение кофеина методом ТСХ в:

кофе и чае разных сортов и качества

Определение железа методом ТСХ в:

гречневой крупе, клубнике, яблоке, ананасе, гранате, шоколаде

 

Качественные реакции на белки

Методы качественного обнаружения белков основаны на двух типах реакций: а) по пептидным связям белковой молекулы; б) по аминокислотным радикалам ее. Примером реакции первого типа служит биуретовая реакция. Примером реакций второго типа являются многочисленные цветные реакции на радикалы аминокислот (реакция Сакагучи — с α-нафтолом, реакция Паули - с нитритом калия, реакция Циммермана — с о-фталевым диальдегидом, нингидриновая реакция и др.)

 

Биуретовая реакция.

К 1-2 мл раствора белка прибавляют двойной объем 30%-ного раствора гидроксида натрия и хорошо перемешивают. Затем из капельницы добавляют несколько капель 1%-ного раствора сульфата меди и снова хорошо перемешивают. Развивается интенсивное красно - фиолетовое окрашивание, свидетельствующее о наличии пептидных, т.е. -СО-NH-, связей в молекуле белка. При малом содержании белка чувствительность реакции можно повысить, наслаивая на раствор белка в щелочи 1 мл 1%-ного раствора сульфата меди. При стоянии на границе двух слоев появляется фиолетовое кольцо.

Для сравнения проводят ту же реакцию с биуретом, который легко может быть получен при нагревании мочевины:

 

2 H₂N-CO-NH₂ → +t → NH₃ + H₂N-CO-NH-CO-NH₂

мочевина биурет

 

Для этого несколько кристаллов мочевины помещают в пробирку и осторожно прокаливают в пламени газовой горелки. По охлаждении приливают в пробирку 10%-ный раствор гидроксида натрия и добавляют несколько капель 1%-ного раствора сульфата меди. После перемешивания развивается сине-фиолетовая окраска.

И в том, и в другом случае окраска вызвана образованием комплексного соединения:

 

Биурет в щелочной среде претерпевает полную енолизацию по схеме:

Две молекулы диенольной формы биурета взаимодействуют с гидроксидом меди (II) и образуют комплексное соединение, в котором координационные связи образованы за счет электронных пар атомов азота иминных групп.

Аналогично построено комплексное соединение меди с енолизированными пептидными группами полипептида.

 

 

Комплексы такого типа обладают преимущественно красной окраской (максимум поглощения в пределах 520-530 нм). В случае образования медных комплексов при участии трех или двух атомов азота окраска их преимущественно фиолетовая и синяя (с максимумами поглощения в пределах 540-580 нм и 615-670 нм соответственно). Поэтому окраска растворов при проведении биуретовой реакции варьирирует от синей до красной с преобладанием фиолетовой.

 

Нингидриновая реакция

К 1-2 мл разбавленного раствора белка приливают 3-4 капли 1%-ного раствора нингидрина в 95%-ном растворе ацетона. Раствор перемешивают и ставят в водяную баню при 70°С на несколько минут. Развивается сине-фиолетовое окрашивание.

Эта реакция обнаруживает в растворе α-аминокислоты. Сначала в результате взаимодействия аминокислоты с нингидрином возникает Шиффово основание. Затем оно претерпевает перегруппировку, декарбоксилируется и расщепляется на альдегид и аминодикетогидринден.

Аминодикетогидринден конденсируется еще с одной молекулой нингидрина, и образовавшееся соединение, енолизируясь, переходит в окрашенную форму, получившую название «сине-фиолетовый Руэмана», по имени исследователя, впервые в 1910 г. изучившего эту реакцию.

 

Ксантопротеиновая реакция.

К 1 мл раствора белка добавляют 5-6 капель концентрированной азотной кислоты до появления белого осадка или мути от свернувшегося белка. При нагревании раствор и осадок окрашиваются в ярко-желтый цвет. При этом осадок почти полностью растворяется. Охлаждают смесь и осторожно добавляют к раствору, имеющему кислую реакцию, не взбалтывая, по каплям избыток концентрированного раствора аммиака или щелочи до щелочной реакции. Выпадающий вначале осадок кислотного альбумината растворяется, и жидкость окрашивается в ярко-оранжевый цвет.

Ксантопротеиновая реакция происходит только при наличии в белках остатков ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана). Желатина, например, не содержит ароматических аминокислот и поэтому она не дает ксантопротеиновой реакции. В результате реакции нитрования по радикалам ароматических аминокислот образуются желтоокрашенные нитросоединения. Изменение желтой окраски в оранжевую в щелочной среде обусловлено появлением хромофорной группы.

 

 

Реакция Сакагучи.

Берут в пробирку 2-3 мл разбавленного раствора белка, добавляют 1 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия и вслед за этим несколько капель 0,2%-ного спиртового раствора α-нафтола. Перемешивают, приливают 0,5 мл раствора гипобромида натрия и вновь перемешивают. Развивается оранжево-красное окрашивание. Появление окраски объясняется взаимодействием α-нафтола в присутствии окислителя с гуанидиновыми группировками радикалов аргинина, имеющимся в молекуле белка.

 

Нитропруссидная реакция.

К 3 мл разбавленного белка приливают равный объем насыщенного раствора сульфата аммония 2-3 капли 5%-ного раствора нитропруссида натрия. Затем раствор подщелачивают несколькими каплями крепкого раствора аммиака. Если в белке присутствует цистеин, то происходит реакция, в результате которой развивается пурпурное окрашивание.

 

Реакция Паули.

К 1 мл 1%-ного раствора сульфаниловой кислоты в 0,5%-ном растворе соляной кислоты приливают 2 мл 0,5%-ного раствора нитрита натрия, сильно встряхивают и немедленно добавляют сначала 2 мл разбавленного раствора белка, а затем, после перемешивания содержимого пробирки, 6 мл 10%-ного раствора карбоната натрия. После смешивания растворов развивается вишнево-красное окрашивание.

Возникновение окраски обусловлено наличием в белковой молекуле остатков гистидина и тирозина.