Носители для иммобилизованных ферментов

Для получения иммобилизованных ферментов используется ограниченное число как органических, так и неорганических носителей. К носителям предъявляются следующие требования (Дж.Порат, 1974):

- высокая химическая и биологическая стойкость;

- высокая химическая прочность;

- достаточная проницаемость для фермента и субстратов, пористость, большая удельная поверхность;

- возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран);

- легкая активация;

- высокая гидрофильность;

- невысокая стоимость.

Классификация носителей схематично представлена на рисунке 4.

Рис. 4. Классификация носителей для иммобилизованных ферментов

Следует отметить, что органические носители (как низко-, так и высокомолекулярные) могут быть природного или синтетического происхождения. Природные полимерные органические носители делят в соответствии с их биохимической классификацией на 3 группы: полисахаридные, белковые и липидные.

Синтетические полимеры также можно разделить на группы в связи с химическим строением основной цепи макромолекул: полиметиленовые, полиамидные, полиэфирные.

Для иммобилизации ферментов наиболее широко используются природные полисахариды и синтетические носители полиметильного типа, остальные применяются значительно реже. Большое значение природных полимеров в качестве носителей для иммобилизации объясняется их доступностью и наличием реакционно-способных функциональных групп, легко вступающих в химические реакции. Характерной особенностью этой группы носителей также является их высокая гидрофильность. Недостаток природных полимеров - неустойчивость к воздействию микроорганизмов и довольно высокая стоимость.

Наиболее часто для иммобилизации используются такие полисахариды, как целлюлоза, декстран, агароза и их производные. Целлюлоза гидрофильна, имеет много гидроксильных групп, что позволяет модифицировать её, замещая эти группы. Для увеличения механической прочности целлюлозу гранулируют путем частичного гидролиза, в результате которого разрушаются аморфные участки. На их место для сохранения пористости между кристаллическими участками вводят химические сшивки. Гранулированную целлюлозу довольно легко превратить в различные ионообменные производные, такие как ДЭАЭ-целлюлоза, КМЦ и т.д.

Широко распространены носители на основе декстрана, выпускаемые под названием "сефадексы". При высушивании они легко сжимаются, в водном растворе сильно набухают. В этих носителях размер пор в геле регулируется степенью сшитости. К группе декстранов относят и крахмал. Химически модифицированный крахмал сшивается агентами, такими как формальдегид. Таким способом был получен губчатый крахмал, обладающий повышенной устойчивостью по отношению к ферментам, гидролизу. Водорастворимые препараты на основе декстрана часто применяются как носители лекарственных средств в медицине.

Хорошим носителем считается агар. Его свойства улучшаются после химической сшивки, например, диэпоксидными соединениями. Такой агар становится устойчивым к нагреванию, прочен, легко модифицируется.

Белки в качестве носителей обладают рядом достоинств: вместительны, способны к биодеградации, могут применяться в качестве тонкой (толщиной 80 мкм) мембраны. Иммобилизацию ферментов на белковых носителях можно проводить как в отсутствие, так и в присутствии сшивающих агентов. Белки используются и в фундаментальных биологических исследованиях, и в медицине. К недостаткам белков в качестве носителей относят их высокую иммуногенность (за исключением коллагена и фибрина). Наиболее для иммобилизации используются структурные (кератин, фибрин, коллаген), двигательные (миозин) и транспортные (альбумин) белки.

Синтетические полимерные носители применяются для ковалентной и сорбционной иммобилизации ферментов, для получения гелей, микрокапсул. Полимеры на основе стирола применяются сорбционной иммобилизации. Они могут иметь макропористую, изопористую структуру, а также гетеропористую структуру. Для получения полимерных гидрофильных носителей широко используется акриламид - производное акриловой кислоты.

Широкое распространение получил метод включения ферментов и клеток в полиакриламидный гель, имеющий жесткую пространственную сетчатую структуру. Полиакриламидный гель устойчив к химическим воздействиям. Очень интересную группу представляют полиамидные носители. Это группы различных гетероцепных полимеров с повторяющейся амидной группой -С(О)-NH-. Например, полимеры на основе N-винилпирролидона используются для получения иммобилизованных ферментов, способных медленно распадаться в организме. Кроме того, они биологически инертны, что особенно важно при использовании в медицинских целях. Существенным недостатком большинства полимерных носителей является их способность накапливаться в организме. В этом отношении предпочтение отдается природным полимерам, которые гидролизуются ферментами. Поэтому в состав лекарственных препаратов часто входит декстран, а из синтетических носителей - полимеры на основе N-винилпирролидона. В настоящее время ведутся эксперименты по созданию синтетических полимеров, расщепляющихся с образованием нетоксичных продуктов обмена.

ВВЕДЕНИЕ В ИНЖЕНЕРНУЮ ЭНЗИМОлОГИЮ

Инженерная энзимология — новое научно-техническое на­правление, основанное на принципах целого ряда областей современного естествознания, в первую очередь химической энзимологии, биохимии, химической технологии, а также инженер­но-экономических дисциплин. Основная задача инженерной энзимологии — разработка биотехнологических процессов, в кото­рых используется каталитическое действие ферментов, как пра­вило, выделенных из состава биологических систем или находя­щихся внутри клеток, искусственно лишенных способности расти.

К инженерной энзимологии относятся соответствующие научно- исследовательские и инженерные разработки, если они ставят своей целью: а) получение нового продукта; б) получение извест­ного продукта, но лучшего качества; в) улучшение технико­экономических показателей процесса по сравнению с аналогич­ными существующими процессами.

1. Перспективы применения иммобилизованных ферментов в пищевой промышленности

Амилазы используются

• для получения чистой глюкозы из кукурузной и маисовой муки в кукурузную и мольтозную патоку, которую затем используют (в крахмало-паточной промышленности),
• для удаления крахмала, который приводят к постепенному загустеванию продуктов, помутнению соков, экстрактов, ухудшению их вида (при производстве овощепродуктов),
• для очистки от крахмала стоков бумажных фабрик (амилазы, иммобилозованные на нейлоне, пористом стекле, окиси никеля и ПАА),
• в перспективе - для получения полисахаридов (крахмала) из отходов (целлюлозной промышленности).

b -амилазу используют

• для получения очищенной мальтозы (сиропы) из крахмала.

Глюкоамилазу, иммобилизованную на целлюлозных волокнах (триацетат целлюлозы, ДЭАЭЦ), ПААГ, глиноземе, активированном угле, пористой полиэфирной пене, деазотированном акриламидом пористом стекле, используют

• для получения глюкозы и фруктозы из крахмала и мальтозы (позволит резко снизить потребности в импорте сахара). Связывание предохраняет фермент от действия протеолетических ферментов микробной флоры. Так, при иммобилизации фермента на ионообменнике имберлите 1В-45 сохранялась высокая стабильность фермента (за 15 дней работы по 8 часов в С°день при температуре 45 активность снизилась на 28 %).

Иммобилизованная в ПААГ глюкоамилаза сохраняла большую стабильность, недостатком являлась ограниченная скорость протекания раствора субстрата через колонку с гель-ферментом. Такие же трудности и при использовании ДЭАЭЦ.

Для гидролиза крахмала применяли две основные реакторные системы: 1)колонку с насадкой, заполненной иммобилизованным ферментом, раствор крахмала пропускали сверху вниз с заданными скоростями; 2)реактор с лопастными колесами для удержания фермента.

Глюкоамилаза (из Aspergilus awamori), иммобилизованная при помощи ионных связей на ДЭАЭЦ в 4-х литровом реакторе с перемешиванием С°при 55 и скорости прохождения 5%-ного крахмала 500 мл/час выход глюкозы составил 29,4 %. При использовании 30 % крахмала и скорости потока 100-360 мл/час выход глюкозы составлял 13,2 %. Продолжительность работы реактора без существенного снижения активности фермента - один месяц.

В качестве примера, реализованного с помощью иммобилизованных ферментов технологического процесса можно привести получение глюкозо-фруктозного сиропа из кукурузного крахмала. Этот сироп используется для получения кондитерских изделий. Процесс осуществляется с помощью трех иммобилизованных ферментов:

1. a -амилазы, катализирующей гидролиз крахмала до олигосахаридов небольшой длины (декстрины);
2. амилоглюкозидазы (глюкоамилазы), с помощью ее получается глюкоза;
3. глюкозоизомеразы, превращающий глюкозу в равновесную смесь глюкозы и фруктозы.

Лактазу (b-галактозидазу), иммобилизованную на пористом листе целлюлозы, ДЭАЭЦ, пористом стекле или измельченном каллогене применяют

• для предупреждения кристаллизации лактозы в кремах, концентратах цельного молока, молочной сыворотке, мороженом. При кристаллизации молочный сахар дает зернистое или песчаное мороженое с пониженными вкусовыми качествами и плохим товарным видом. Кроме того, ферментные препараты на основе b-галактозидазы также применяются
• для удаления лактозы из продуктов питания, к которой у некоторых людей бывает врожденная непереносимость. Применение для этой цели галактозидазы представляется перспективным.

Галактозидаза, присоединенная к пористым листам целлюлозы и ДЭАЭ-целлюлозы теряла стабильность при замораживании и оттаивании. При хранении в течение 3-5 С°не­дель при 2 препараты нековалентно связанной галактозидазы теряли 4-6 % активности в неделю, а ковалентно связанной - 1 - ­1,7 % активности в неделю (Шарп и сотр.). Иммобилизованная на пористой целлюлозе галактозидаза имела активность, равную активности исходного фермента.

a -галактозидазу, иммобилизованную на микроволокнистом нейлоне, применяли в проточном реакторе

• для гидролиза стахиозы из соевых бобов, раффинозы в разбавленной свекольной мелассе (черной патоке).

Разрабатываются способы применения иммобилизованных ферментов для обработки и утилизации отходов пищевых про­дуктов. Так, Роуэр ___ проназу и b-галактозидазу, свя­занные с пористым стеклом использовали

• для разрушения b-лактоглобулинов из сыворотки молока. Водонерастворимые комплексы проназы с КМ-целлюлозой оказались устойчивым против автолиза и имели более высокую стабильность по сравнению с растворимым фермен­том. Применение иммобилизованных ферментов позволит также
• получать аминокислоты из гидролизатов сы­воротки молока и углеводов.

Перспективным является использование инвертазы -b(фруктофуранозидазы), иммобилизованной в поры триацетатцеллюлозного, диацетатцеллюлозного, этилцеллюлозного, поливинилхлоридного и др. волокон

• для получения инвертного сахара гидролизом сахарозы. Инвертный сахар используется в кондитерской промышленности, так как обладает высокой гигроскопичностью (замедляет высыхание, препятствует образованию крупнокристаллических структур, обуславливающих затвердевание кондитерских изделий - помадных конфет, пастилы, вафель).

Целлюлотические ферменты (целлюлаза, гемицеллюлаза, пулаланаза и др.) еще не нашли широкого применения в пищевой промышленности, однако их использование к качестве иммобилизованных ферментов весьма перспективно

• для для получения глюкозы и др. пищевых сахаров из целлюлозного сырья. Можно использовать микробные целлюлазы (Aerobacter aerogenes, Cellulomonos sp. и др.).

Широкие перспективы для использования иммобилизованных ферментов вообще и в пищевой промышленности в особенности открывает применение реакторов на иммобилизованных ферментах в сочетании с ультрофильтрационной мембраной. Применялась для непрерывного гидролиза -амилазойaкрахмала иммобилизованными и глюкоамилазой.

В пищевой промышленности широко используется глюкозооксидаза (окисляет глюкозу в глюконовую кислоту)

• для удалением кислорода из пищевых продуктов и увеличения сроков хранения (фруктовых соков, пива, безалкогольных напитков и т.д.). Яичный порошок, как известно, содержит глюко­зу, и ее постепенное окисление ухудшает пищевую ценность порош­ка - появляется неприятный вкус и порошок приобретает коричневую окраску. Обессахаривание предотвраща­ет эти изменения.

В литературе описан способ ковалентного связывания глюкозооксидазы с никельалюмосилакатным носителем, предваритель­но активированным -амидопролтриэтоксиланом,g а затем дей­ствием тиофосгена, переведенным в изотиоцианатное производное. Наилучшие характеристики подучили для носителя, который содержал 2-8 % Ni (по весу). Время полуинактивации С°глюкозооксидазы при 5 составляло 10 суток. Интересно отметить, что активность полученного на таком носителе фермента состав­ляла только 50 % от активности глюкозооксидазы, связанной с порис­тым стеклом. Глюкозооксидаза из Aspergillus niger, внедрен­ная в коллаген при помощи электрофореза, в начальный период работы быстро теряет активность (до 15 % от исходной), что объяс­няется частичным вымыванием фермента, непрочно связанного с матрицей, однако остаточная активность затем сохраняется в те­чение трех месяцев без изменения.

Кестнером и сотрудниками показана возможность удаления кислорода из фруктовых соков при помощи иммобилизованной в ПААГ глюкозооксидазы При низкой скорости пропускания соков (0,6-0,7 мл/мин, 30°С) степень удаления кислорода составляла 70-80 % от исходного количества. В течение 9 часов работы с вишневым соком активность иммобилизованной глюкозооксидазы ос­тавалась постоянной.

В работе 370 Показана возможность приме­нения иммобилизованной глюкозооксидазы в системе с другими фер­ментами (каталазой и протеолитическими ферментами) для удале­ния кислорода, глюкозы, перекиси водорода и белков из пищевых продуктов.

Тепловая обработка молока с целью пастеризации наряду с разрушением патогенных микроорганизмов как правило инактивиру­ет некоторые ферменты (липазу, фосфатазу, протеазы), а также кислотообразующие микроорганизмы. Поэтому "холодная" стерили­зация молока при помощи перекиси водорода представляется более перспективной, так как количество патогенных микроорганизмов при такой обработке резко уменьшается, в то время как микроор­ганизмы, продуцирующие молочную кислоту, не затрагиваются.

Показана высокую эффективность применения иммобилизованной каталазы

• для удаления перекиси водорода в молоке после "холод­ной" стерилизации. Однако сам субстрат инактивировал каталазу.

Для целей стерилизации пригодной оказалась и иммобилизованная лактопероксидаза: при обработке клеток небольшими количествами нерастворимого фермента содержание жизнеспособных клеток уменьшалось почти на 50 %.

В работе __ Описано применение пепсина, иммобилизованного на стекле

• для непрерывного створаживания молока. 0,05 М раствор перекиси водо­рода, используемый для стерилизации, не инактивирует фермент.

Каталаза, связанная со стеклом при помощи глутарового альдегида была исполь­зована

• для последующего удаления перекиси водорода, причем активность иммобилизованной каталазы была близка к нативной. Каталаза, иммобилизованная таким способом, была стабильна при кислых и нейтральных значениях рН и невы­сокой ионной силе раствора в течение трех месяцев. В производстве пива и фруктово-ягодных соков иммобилизованные ферменты могут быть использованы для удаления нежела­тельных примесей.

Иммобилизованые пектиназы могут быть ис­пользованы

• для осветления (депектанизации вин и ягодных соков, так как оставшийся в растворе пектин способствует образованию осадка.

Папаин, иммобилизованный на алкиламидном пористом стекле,также пригоден

• для удаления мути из вин и фруктово-ягодных соков. Этот фермент, и помещенный в реактор непрерывного действия, сохранял 50 % активности после 35 суток.

Интересными объектами для иммобилизации могут быть также пектиндеполимеразы, применяемые

• для экстрак­ции оливкового масла при механической обработке маслин.

Иммобилизованная нарингиназа может найти применение

• для удаления горького привкуса соков цитрусовых, обусловленного присутствием нарингина (7-рамнозидо-В-глюкозадо-4,5,7-три­оксифлавонола).

2. Применение иммобилизованных ферментов в медицине

Применение иммобилизованных ферментов вместо растворимых оказалось в ряде случаев предпочтительным при использовании в качестве медицинских препаратов. Такие препараты в силу большей устойчивости дольше удерживаются в организме (обладают пролонгированным действием). Кроме того, можно создавать разнообразные, удобные для применения формы таких ферментов. Например, иммобилизация протеаз на целлюлозе позволяет получать обладающее протеолитической активность повязки и тампоны, что удобно при использовании таких ферментов для заживлении ран, язв и прочих поражений тканей (Д.Г. Кноре, С.Д.Мызина, 1992).

Препараты иммобилизованных ферментов могут найти применение в медицине

• в терапевтических целях, так как целый рад заболеваний человека обусловлен специфической фермен­тной недостаточностью.
• для проведения различных клинических анализов, позволяющих быстро и количественно установить содержание интере­сующих клиницистов соединений в соответствующем объекте ана­лиза. Применение натив­ных ферментов в терапевтических целях осложняется их анти­генными свойствами, а также малым временем жизни фермента в организме. Их применение также неоправданно из-за их малой стабильности и дороговизны.

В области терапии можно выделить следующие основные направления применения иммобилизованных ферментов:

1. Введение в организм иммобилизованных ферментов для покрытая специфической ферментной недостаточности.
2. Введение в организм или использование в соответствующих аппаратах типа "искусственной почки" или "искусственной печени" иммобилизованных ферментов для удаления избыточных количеств вредных метаболитов, в первую очередь из крови.
3. Покрытия дефицита пищеварительных ферментов, возникшего в результате хирургического удаления части желудка Оли пищевода.
4. Использование иммобилизованных ферментов для борьбыс накоплением эндотоксинов в процессе заживления ран и ожо­гов.
5. Применение некоторых иммобилизованных ферментов для лечения определенных злокачественных новообразований.

Имеющиеся на сегодняшний день данные по применению нативных ферментов свидетельст­вуют о том, что из-за быстрого разложения вводимого в организм фермента и из-за вызываемой им, как чужеродным белком, сильной иммунологической реакции заметного успеха добиться не удается, хотя известны примеры лечения некоторых злока­чественных новообразований, в частности лимфосаркомы, на­тивной аспарагиназой.

Одним из наиболее важных примеров использования иммобили­зованных ферментов в клинических анализах является метод опре­деления содержания глюкозыв крови с помощью глюкозооксидады, включенной в акриламидный гель.

Другой пример такого рода - это определение содержания мочевины в различных биологических жидкостях, например в моче или плазме крови, с помощью иммобилизованной уреазы. При этом содержание мочевины может быть определено как по количеству выделенного аммиака, так и по изменению значения рН исследуемого раствора. Подобные системы могут функционировать как непрерывно действующие.

При некоторых заболеваниях, в частности при опухолях пищеварительной системы, наблюдается заметное изменение концентрации в моче хотя бы одного из дисахаридов - лактозы или сахаро­зы. С целью определения концентрации лактозы в моче предложено использовать иммобилизованную лактозу и сахаразу.

В последнее время для определения концентраций некоторых соединений разработаны так называемые ферментные электроды, получаемые из обычных селективных электродов покрытием их гелевой пленкой со связанным в ней ферментом.