Использование в вирусологии культур клеток. Типы культур клеток. Получение клеточных культур.

10.1 Типы культур клеток. Культура клеток – это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма (in vitro).

Методика культивирования клеток особенно успешно стала развиваться после 40-х годов текущего столетия. Этому способствовали следующие обстоятельства: открытие антибиотиков, предотвращающих бактериальное заражение культур клеток, открытие Хуангом (1943) и Эндерсом (1949) способности вирусов вызывать специфическую деструкцию клеток (цитопатический эффект) – удобный метод индикации вирусов в культурах клеток, и, наконец, Дульбекко и Фогт (1952) предложили методику трипсинизации тканей и получения однослойных культур клеток.

В вирусологической практике применяют следующие культуры клеток.

Первично-трипсинизированные культуры клеток – клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой (рис. 26). Культуру клеток можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного (взрослого или эмбриона). Однако лучше это удается сделать из эмбриональных органов, так как клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для этих целей используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных.

Рисунок 26. Первичная культура клеток легких эмбриона овцы (по Троценко Н.И. и др.)

Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 ч после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают их на кусочки (1-4 мм) и обрабатывают ферментами: трипсином, панкреатином, коллагеназой и другими (чаще трипсином). Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37 °С.

Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делиться. В развитии культур клеток различают несколько фаз: адаптации, логарифмического роста, стационарную и старения (гибель клеток). Размножаясь, клетки размещаются на поверхности стекла и при полном покрытии его в один слой контактируют друг с другом и прекращают делиться (контактная ингибиция). На стекле формируется слой толщиной в одну клетку (поэтому эти культуры клеток называют однослойными или монослойными).

Обычно монослой формируется через 3–5 дней. Скорость его формирования зависит от вида ткани, возраста животного, качества питательной среды, посевной концентрации клеток и других факторов.

Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохраняет жизнеспособность в течение 7–21 дня (в зависимости от вида клеток и состава питательной среды).

Интенсивность размножения клеток и состояние монослоя контролируют визуально под малым увеличением микроскопа (объектив х10). Лучше для этой цели использовать инвертированный микроскоп.

Для культивирования вирусов используют молодые культуры клеток (как только сформировался монослой).

Субкультуры. В вирусологической практике часто используют субкультуры, которые получают из первичных клеток, выращенных в матрасах, путем снятия их со стекла раствором версена или трипсина, ресуспендирования в новой питательной среде и пересева на новые матрасы или пробирки. Через 2–3 сут формируется монослой.

Практически субкультуру можно получить из всех первичных культур клеток. (Хуже субкультивируются куриные фибробласты.) Субкультуры по чувствительности к вирусам не уступают первичным культурам клеток, кроме того, они более экономичны, и есть возможность выявления контаминации клеток вирусами. Субкультуры получают от 2–5 пассажей (перевивок) и очень редко до 8–10. Последующие пассажи приводят к изменению морфологии клеток и их гибели.

Если клеточные культуры прошли более 10 пассажей, они уже на стадии перехода к перевиваемым культурам клеток.

Перевиваемые культуры клеток – это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лабораториях их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой (при условии замены питательной среды).

Получают перевиваемые клетки из первичных культур клеток с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме культивирования. Обычно работа по получению новых клеточных линий продолжается несколько месяцев. Полагают, что механизм происхождения перевиваемых культур клеток – результат генетической изменчивости клеток или селекции единичных клеток, присутствующих в первичной исходной культуре.

Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом (у первичных клеток он диплоидный), стабильны в условиях роста in vitro, некоторые из них обладают онкогенной активностью. Последнее свойство ограничивает использование перевиваемых культур клеток для культивирования вирусов при производстве вакцин.

Перевиваемые культуры клеток можно получать как из здоровых тканей животных, так и из опухолевых. Среди них наиболее широко используют следующие линии клеток: HeLa (из раковой опухоли шейки матки женщины); Нер-2 (из карциономы гортани человека); KB (из раковой опухоли полости рта); ВНК-21 (почка новорожденного хомячка); ППЭС (перевиваемая почка эмбриона свиньи); ППТ (перевиваемая почка теленка); ППО (перевиваемая почка овцы); TR (из слизистой трахеи коровы); L (мышиные фибробласты); СОЦ (из сердца обезьяны циномольгус) и др.

Перевиваемые клетки имеют преимущества перед первичными: их приготовление значительно проще, экономятся труд и материальные средства; эти культуры заранее можно проверить на наличие латентных вирусов и микрофлоры; клональные линии обеспечивают более стандартные условия для размножения вирусов, чем первичные, представляющие смешанную популяцию клеток. Большинство перевиваемых клеток обладает более широким спектром чувствительности к вирусам, чем соответствующие первичные культуры.

Однако перевиваемые клетки имеют и недостатки: они склонны к малигнизации, т. е. злокачественное перерождение независимо отпроисхождения и снижения чувствительности к вирусам у них происходит быстрее, чем у первичных, поэтому необходимо применять клональные линии перевиваемых клеток.

Поддерживают перевиваемые клетки путем периодических пересевов. Чаще используют бесцентрифужный метод. Для очередного пересева отбирают 2–3-дневную культуру с хорошим монослоем, сливают питательную среду, а клеточный монослой покрывают подогретым до 35-37°С 0,02%-ным раствором версена. Диспергирующее действие версена объясняется связыванием им двухвалентных катионов (Mg⁺⁺, Ca⁺⁺), которые способствуют прикреплению клеток к стеклу и обеспечивают целостность клеточной культуры. Под действием версена клетки округляются, отделяются от стекла.

Через 10–15 мин после округления клеток версен сливают, оставляя небольшое количество его (в 1-литровом матрасе – 5-–10 мл, в 0,1-литровом – 2–3 мл), и выдерживают еще 5–10 мин, периодически омывая клетки версеном, затем добавляют небольшое количество питательной среды. После встряхивания подсчитывают клетки в камере Горяева, исходную клеточную взвесь разводят ростовой питательной средой до необходимой концентрации (80–200 тыс. в 1 мл) и разливают при помешивании в пробирки или матрасы, закрывают резиновыми пробками и культивируют в термостате при 37 °С в течение 3–4 дней до образования сплошного монослоя. Обычно клетки в камере Горяева не подсчитывают, а пересевают с коэффициентом от 1:2 до 1:6 в зависимости от вида клеток. Состав питательной среды также зависит от вида клеток, но чаще при культивировании перевиваемых клеток используют среды Игла, 199 или смеси этих сред с гидролизатом лактальбумина.

Важно отметить, что при поддержании перевиваемых клеток путем их систематического пересева в лаборатории оставляют не менее одного матраса без пересева на случай непригодности последнего пассажа.

Диплоидные культуры клеток. Международный комитет по клеточным культурам дал следующее определение диплоидным клеткам: это морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся тремя фазами роста, сохраняющая в процессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая туморогенной активностью при трансплантации хомячкам.

Диплоидные культуры клеток, так же как и перевиваемые, получают из первичных культур клеток. Кариотип клеток очень лабилен и при обычных методах культивирования клеток он изменяется в первые дни. Поэтому потребовались специальные методы обработки ткани, высокого качества питательные среды, фетальная сыворотка для длительного поддерживания клеток in vitro в диплоидном состоянии. Эту задачу впервые успешно решили американские ученые Хейфлик и Мурхед (1961).

Диплоидные клетки получены из различных тканей эмбриона человека (легкие, почки, кожно-мышечная ткань, сердце и др.) и животных (почка эмбриона крупного рогатого скота, свиней, ВНК-21 – почка хомяка и др.).

Диплоидные клетки в отличие от перевиваемых имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пассажей 50±10, затем количество делящихся клеток резко уменьшается и они гибнут. Однако диплоидные клетки могут быть использованы в течение длительного времени, так как при каждом пассаже часть клеток можно заморозить (минус 196 °С) и при необходимости восстановить.

Диплоидные клетки имеют преимущества перед перевиваемыми и первичными клетками: 10–12 дней они могут быть в жизнеспособном состоянии без смены питательной среды; при смене среды один раз в неделю остаются жизнеспособны в течение 4 нед; особенно пригодны для длительного культивирования вирусов, у них сохранена чувствительность исходной ткани к вирусам.

Суспензионные культуры клеток. В 1953 г. Оуэне с сотр. показали способность клеток размножаться в свободно суспендированном состоянии. В последующие годы этот метод был значительно усовершенствован: была создана современная аппаратура, обеспечивающая размножение клеток со строго заданными параметрами (температура, рН, скорость перемешивания), а также адаптированы многие линии перевиваемых клеток к размножению в этих условиях (ВНК-21, Нер-2, МДВК и др.). Выращивание вирусов в суспензионных культурах клеток открывает большие возможности в промышленном производстве вакцин и диагностикумов. Однако только перевиваемые клетки хорошо культивируются в суспензии.

Новый подход к культивированию клеток в суспензии – применение микроносителей (сефадекс, силикагель, цитолар и др.). На микроносителях культивируемые клетки формируют монослой. Таким образом, этот способ позволяет методами суспензионного культивирования выращивать зависимые от прикрепления к твердому субстрату клетки: первичные, субкультуры, диплоидные. Эти клетки принято называть поверхностно зависимыми.

Способ культивирования на микроносителях (рис. 27) в настоящее время чрезвычайно популярен, так как он открывает большие перспективы в клеточной биотехнологии, в получении вакцин и других биологически активных веществ (интерферон, гормоны и т. д.).

Рисунок 27. Культивирование клеток на микроносителях (схема)

10.2 Хранение культур клеток. Каждый из трех основных типов клеточных культур – первичных культур, диплоидных штаммов и перевиваемых линий клеток, используемых в вирусологических исследованиях, часто приходится консервировать, так как при продолжительном пассировании клеток in vitro есть опасность бактериального загрязнения и неконтролируемых (генетических) изменений самих клеток.

Наиболее простой метод консервирования культур клеток – хранение их при 4 °С до 1–6 нед. Успешно применяют хранение клеточных штаммов в условиях сухого льда (минус 78 °С) и жидкого азота (минус 196 °С). Для этого клетки снимают с матрасов, суспендируют в концентрации 10⁶ в 1 мл питательной среды, содержащей в качестве защитных веществ 10–40 % сыворотки и 10 % очищенного стерильного глицерина (вместо глицерина успешно применяют ДМСО – диметилсульфоксид). Затем клеточную суспензию разливают в ампулы, запаивают и выдерживают 1–3 ч при 4 °С, после чего замораживают клетки в смеси этилового спирта с сухим льдом. Скорость охлаждения не должна превышать 1 °С в 1 мин. При снижении температуры до минус 25 °С ампулы помещают для хранения в сухой лед. Если для хранения используют жидкий азот, то ампулы с клетками охлаждают до минус 70 °С и кладут в жидкий азот. Хранение клеток в жидком азот е в течение ряда лет не изменяет их пролиферативную активность и чувствительность к вирусам.

Восстанавливают замороженные клетки следующим образом: ампулу с замороженными клетками быстро погружают в водяную баню на 1–2 мин при легком встряхивании, затем клетки выливают в матрас, добавляют соответствующее количество ростовой среды и культивируют в термостате при 37 °С. Для удаления глицерина или ДМСО питательную среду заменяют на следующий день после посева.

При транспортировке клеток матрасы с выросшим монослоем заливают средой доверху и закрывают резиновой пробкой. В лаборатории питательную среду сливают и используют при культивировании этих клеток в виде добавок к питательной среде, применяемой в данной лаборатории.

Можно транспортировать и клеточную суспензию при 4 °С. При благоприятных условиях транспортировки, исключающих перегревание и замораживание клеток, 80–90 % из них сохраняют жизнеспособность до 7–8 дней.

Работа с культурой клеток требует абсолютной стерильности, тщательной подготовки посуды, соответствующих растворов, питательных сред и высокого качества воды.

10.3 Контаминация культур клеток. Работа с культурами клеток, их использование в вирусологических и других исследованиях, в биотехнологии требуют постоянного контроля на отсутствие посторонних агентов (контаминантов). Контаминантами могут быть вирусы, бактерии, грибы, микоплазмы и клетки других клеточных культур. Микоплазмы – одни из наиболее частых контаминантов, особенно в перевиваемых линиях клеток. Своевременное выявление их, других микроорганизмов или вирусов в культуре клеток – важное условие поддержания высокого качества последней. Паспортизация стабильных клеточных линий предусматривает в качестве необходимого теста контроль на отсутствие микоплазмоконтаминации, что должно стать обязательным для всех лабораторий, где работают с культурами клеток.

Резкое закисление питательной среды в культуральных флаконах и опалесценция ее могут быть следствием контаминации культур клеток микоплазмами. Для выявления последних используют следующие методы: посев на питательные среды, тест-культуры, цитологические, радиоавтографические и электронно-микроскопические.

В случае контаминации клеточные культуры уничтожают, а культивирование возобновляют из резервных расплодок, хранящихся в жидком азоте. Только редкие и уникальные культуры подлежат деконтаминации.

Предупредить размножение и подавить случайно попавшие в клеточную культуру бактерии удается с помощью противомикробных препаратов (антибиотиков и др.), добавляемых в ростовые среды непосредственно перед их использованием. Эти препараты следует строго дозировать и применять дифференцированно. Их использование – необходимое условие при возрастании риска контаминации в процессе получения первичных культур клеток при крупномасштабном суспензионном выращивании клеток, массовом производственном культивировании перевиваемых клеток, а также во всех случаях объединения клеточного материала.

При работе с культурами клеток используют многие антимикробные (нетоксичные) препараты в оптимальных дозах, характер действия которых приведен в таблице 5. Выбор эффективного препарата или комплекса препаратов зависит от чувствительности к ним конкретных контаминантов.

Таблица 5.

Противомикробные препараты для культур клеток (Л. П. Дьяконов и др.)

Препарат	Чувствительные микроорганизмы	Антимикробное действие	Оптимальные концентрации для культур клеток (Ед/мл, мкг/мл)
Пенициллин	Б +	Бактерицидное	100,0
Стрептомицин	Б±	Бактерицидное	100,0
Мономицин	Б±, М	Бактерицидное	100,0
Неомицин	Б±, М	Бактерицидное	50,0
Канамицин	Б±, М	Бактерицидное	200,0
Гентамицин	Б±, М	Бактерицидное	200,0
Полимиксин	Б±	Бактерицидное	50,0
Фурагин	Б±	Бактерицидное	8,0

Обозначения: Б+ – грамположительные бактерии; Б– -грамотрицательные бактерии; М – микоплазмы

10.4 Растворы. Наиболее широко используют при работе с культурами клеток растворы Хенкса и Эрла, которые готовят на бидистилли-рованной воде с добавлением различных солей и глюкозы.

Раствор Хенкса: на 1 л бидистиллированной воды 8,0 rNaCl, 0,4 г КС1, 0,1 г MgSO₄-7H₂O, 0,14 г СаС1₂, 0,06 г КН₂РО₄, 0,06 г NaH₂PO₄, 1,0 г глюкозы, 0,02 г фенолрота, 0,07 г NaHCO_v

Раствор Эрла: на 1 л бидистиллированной воды 6,8 г NaCl, 0,4 г КС1, 0,1 г MgSO₄, 0,2 г СаС1₂, 0,125 г NaH₂PO, 2,2 г NaHCO₃, 1,0 г глюкозы.

Эти сбалансированные солевые растворы используют для приготовления всех питательных сред, так как они обеспечивают сохранение рН, осмотическое давление в клетках и соответствующую концентрацию необходимых неорганических веществ. Кроме того, их применяют при различных манипуляциях с культурой клеток (отмывание от ростовых сред, разведение вируса и т. д.).

При культивировании клеток применяют диспергирующие растворы трипсина и версена. Раствор трипсина (0,25%-ный на фосфатном буфере) используют для разделения кусочков тканей на отдельные клетки и для снятия слоя клеток со стекла. Раствор версена – натриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (0,02%-ный на растворе Хенкса) – используют для снятия клеток со стекла. Все растворы стерилизуют при соответствующих режимах.

10.5 Питательные среды. Различают естественные и искусственные (синтетические и полусинтетические) питательные среды.

Естественные среды состоят из смеси солевого раствора (Хенкса, Эрла), сыворотки крови (животных или человека), тканевого (эмбрионального) экстракта (эмбрионов кур, коров, человека), коровьей амниотической жидкости и т. д. Количество каждого компонента в разных примесях сред значительно варьирует. Используют эти среды редко.

В настоящее время применяют в основном искусственные питательные среды. К полусинтетическим питательным средам относят ферментативные гидролизаты различных белковых продуктов: гидролизат лактальбумина, мышечный ферментативный гидролизат, фермснтативно-казеиновый дрожжевой гидролизат, гемогидролизат, аминопептид и др. Наиболее широко используют в вирусологической практике 5%-ный раствор гидролизата лактальбумина, 5%-ный и 2,5%-ный раствор гемогидролизата.

Из синтетических сред наиболее широкое применение нашли среда 199 и среда Игла. В состав среды 199 входит более 60 компонентов: 20 аминокислот, 17 витаминов, компоненты нуклеиновых кислот, источники липидов, 8 минеральных солей и другие вещества. В состав среды Игла также входит не менее 60 компонентов, включающих аминокислоты, витамины, углеводы и т.д.

Во все питательные среды и некоторые солевые растворы добавляют индикатор феноловый красный (0,002 %) для определения концентрации водородных ионов (рН). В принятой концентрации он не оказывает токсического воздействия на клетки и вирусы. При снижении рН среда желтеет, что позволяет определять момент ее закисле-ния продуктами метаболизма клеток до уровня, требующего замены среды на свежую; при сдвигах рН в щелочную сторону растворы принимают красно-малиновый цвет. При нейтральном значении рН (7,2– 7,4) цвет среды оранжево-красный. Для регулирования рН солевых растворов и питательных сред используют 7,5%-ный раствор бикарбоната натрия (NaHCO₃) и 3%-ный раствор уксусной кислоты (СН₃СООН). Для уничтожения микрофлоры перед использованием в среды добавляют антибиотики: пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/мл. Для подавления плесени используют натриевую соль нистатина по 100 мкг на 1 мл среды.

Все питательные среды принято делить на две группы:

- ростовые, обеспечивающие жизнь и размножение клеток. Они содержат 2–10 % сыворотки крови, применяются в первые дни культивирования клеток;

- поддерживающие, обеспечивающие жизнедеятельность клеток, но не размножение их. Они не содержат сыворотки крови, используются обычно после заражения культуры клеток вирусами.

Сыворотка крови крупного рогатого скота – обязательный компонент ростовых питательных сред. В ее состав входит ряд биологически активных веществ, необходимых для роста клеток in vitro. Содержащиеся в сыворотке активная фракция альбуминов и фетуин способствуют прикреплению клеток к поверхности стекла. В практической работе наибольшее применение нашли сыворотки как взрослого крупного рогатого скота, так и телят, получаемые на мясокомбинатах. Самая лучшая сыворотка для культуры клеток – сыворотка эмбрионов коров. При получении сыворотки следует соблюдать строгую стерильность. Каждая серия сыворотки проходит контроль на стерильность и токсические свойства по отношению к культурам клеток.

10.6 Посуда. Качество посуды имеет важное значение для успешного культивирования клеток вне организма. Посуда должна быть стерильной, обезжиренной, не обладать токсическим действием. Для культивирования клеток используют пробирки, матрасы на 50, 100, 250, 500, 1000 и 1500 мл, роллерные колбы на 500, 1000, 2000 мл, различные пипетки, флаконы для питательных сред и растворов, колбы различной вместимости, воронки и др.

Предложено много способов обработки посуды, и в каждой лаборатории применяют один из них, наиболее экономичный, удобный и дающий наилучшие результаты. При культивировании клеток особенно большие требования предъявляют к подготовке и стерилизации посуды, пробок и др. Во многих случаях неправильная их мойка и стерилизация служат причиной неприкрепления клеток к стеклу или быстрой дегенерации клеточного монослоя.

Обработка стеклянной посуды состоит из нескольких этапов:

1) инфицированную посуду погружают в 2–3%-ный раствор NaOH на 5–6 ч;

2) споласкивают в 3–4 сменах водопроводной воды;

3) замачивают (на ночь) в 0,3–0,5%-ном растворе порошка «Лотос», «Лоск» или мыла Б;

4) тщательно моют с помощью ерша в теплом растворе порошка «Лотос» или «Лоск»;

5) споласкивают в нескольких сменах (8–10 раз) водопроводной воды;

6) споласкивают в дистиллированной воде, содержащей 0,5 % НС1;

7) споласкивают 4–5 раз водопроводной водой и в трех сменах дистиллированной воды;

8) сушат в сушильном шкафу;

9) монтируют и стерилизуют в сушильном шкафу (180 °С, 3–4 ч), кроме резиновых пробок, или автоклавируют (при 200 кПа 1,5–2 ч).

Всю новую посуду моют теплой водой с мылом, споласкивают водой и погружают на 3 ч в хромпик (100 г двухромовокислого калия на 1 л концентрированной серной кислоты), затем в течение 9 ч промывают в проточной воде и нескольких сменах дистиллированной воды, сушат, монтируют и стерилизуют. Старую, бывшую в употреблении посуду обрабатывают хромпиком лишь периодически и не более чем в течение 1 ч.

Новые резиновые пробки кипятят 1 ч в 5%-ном растворе двууглекислой соды, затем промывают несколько раз горячей водопроводной водой и кипятят каждый раз по 1 ч в шести сменах дистиллированной воды. Пробки, бывшие в употреблении, автоклавируют или кипятят 1 ч. Очищают щеткой, прополаскивают несколько раз водопроводной и один раз дистиллированной водой. Затем кипятят в дистиллированной воде 1 ч, споласкивают в трех сменах дистиллированной воды, стерилизуют в автоклаве.

Металлические инструменты моют горячей водой с мылом, промывают водопроводной и дистиллированной водой, стерилизуют кипячением в дистиллированной воде в течение 30 мин. Во время работы в стерильном боксе инструменты находятся в стакане с 96%-ным этиловым спиртом, перед использованием инструменты прожигают пламенем горелки.

В последние годы получили широкое распространение и с успехом применя­ются в лабораториях пластмассовые флаконы, пробирки, чашки Петри и плас­тины с лунками, предназначенные для одноразового использования. В основ­ном такая посуда выпускается стерильной, готовой к использованию. Пластины с лунками обрабатывают этиловым спиртом и стерилизуют ультрафиолетовым светом.

Для культуральных пробирок и флаконов выпускают пробки из нетоксичес­кой силиконовой резины. Обычные резиновые пробки и шланги перед исполь­зованием в работе с культурой ткани кипятят в 5 %-ном растворе углекислого натрия и споласкивают несколько раз в дистиллированной воде.