Занятие 6-7. Общие свойства ферментов. Основы кинетики ферментативного катализа.

Цель занятия: изучить свойства ферментов, обусловленные их белковой природой, их механизм действия и классификацию.

Студент должен знать:

1.Прямые и косвенные доказательства белковой природы ферментов.

2.Структурно-функциональная организация молекул ферментов.

3.Общие свойства ферментов как катализаторов.

4.Механизм действия ферментов (этапы ферментативной реакции).

5.Свойства ферментов, обусловленные их белковой природой.

6.Факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции.

7.Характеристика кинетических параметров – максимальная скорость, константа Михаэлиса.

8.Единицы активности ферментов.

9.Принцип классификации, современная классификация и номенклатура ферментов.

Студент должен уметь:

1. Построить название фермента, исходя из характера субстрата и химического превращения.

2. Оценить графически результаты лабораторного определения рН-зависимости и его зависимости от температуры. Определить температурный и рН-оптимум фермента.

4. Строить график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата, находить константу Михаэлиса.

 

Студент должен получить представление:

1. О существовании заболеваний, обусловленных дефектами генов, ответственных за синтез белков-ферментов;

2. О возможностях, которые предоставляет энзимология практической медицине.

 

Сведения из базовых дисциплин, необходимые для изучения темы:

1. Основные положения о катализе.

2. Сведения о связи структуры и функции.

 

Задания для самоподготовки:

Изучите материал темы в соответствии с целевыми вопросами («студент должен знать») и письменно выполните следующие задания:

1. Определить содержание понятий: «фермент», «активный центр», «кофактор», «кофермент», «апофермент». Назовите основные коферменты.

2. Объясните причину ускорения реакции в присутствии фермента

3. Проверьте свои знания: Активный центр фермента формируется на уровне (один правильный ответ): а. первичной структуры; б. вторичной структуры; в. третичной

4. Запишите этапы ферментативной реакции символами: E, S, P. Охарактеризуйте каждый этап. С образованием какого продукта связано снижение энергетического барьера (энергии активации).

5. Проверьте свои знания: В ходе ферментативного катализа при образовании фермент-субстратного комплекса (несколько правильных ответов):

а. Изменяется конформация субстрата

б. Образуются нековалентные связи между субстратом и ферментом

в. Сближаются функциональные группы, участвующие в катализе

г. Изменяется порядок соединения аминокислот в молекуле фермента

д. Усиливается комплементарность между ферментом и субстратами

6. Заполните таблицу: Свойства ферментов

Общие свойства ферментов как катализаторов	Свойства ферментов, обусловленные их белковой природой

7. Проверьте свои знания: Выберите правильное утверждение:

а. катализатор ускоряет реакцию, но не участвует в ней

б. катализатор ускоряет реакцию, образуя промежуточные соединения с исходными продуктами, и входит в состав конечных продуктов;

в. катализатор ускоряет реакцию, взаимодействуя с реагирующими соединениями, но не входит в состав конечных продуктов;

8. Проверьте свои знания: Вещества А и Б взаимодействует по схеме А+ Б;® АБ. При заданной концентрации А и Б через 30 мин после их смешивания устанавливается подвижное равновесие – скорость прямой и обратной реакции уравниваются.

Какие из приведенных характеристик изменит внесение катализатора?

9. Что является предметом изучения в разделе энзимологии – ферментативной кинетике?

10. Перечислите факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций. Постройте графики зависимостей скорости реакций от температуры, рН среды, концентрации фермента и субстрата. Объясните характер кривой. На графике зависимости V от [S] укажите V_max, K_m

11. Дайте содержание понятия «индуцируемая адаптация ферментов»

12. Проверьте свои знания: Характер зависимости скорости ферментативной реакции от температуры зависит от:

а. ионной силы раствора; б. ионизации функциональных групп фермента;

в. денатурации молекулы фермента; г. тепловой денатурации субстрата

13. Проверьте свои знания: Характер зависимости скорости ферментативной реакции от рН среды зависит от:

а. ионизациии функциональных групп фермента;

б. ионизации субстрата;

в. конформации фермента и его активного центра

14. Проверьте свои знания: Определите соответствие:

А. Константа Михаэлиса

Б. Максимальная скорость

В. Оба параметра

Г. Ни один

1. Параметр кинетики ферментативного катализа

2. Величина, при которой все молекулы фермента находятся в форме ES

3. Чем больше величина, тем меньше сродство к субстрату

4. Концентрация субстрата при котором достигается насыщение

15. Активность фермента определяют по скорости ферментативной реакции. На чем основано определение скорости? 1…, 2….

16. Активность фермента выражают в единицах активности. Назовите эти величины.

17. На чем основана классификация ферментов?

Запомните, чтобы назвать фермент по написанным реакциям требуется: сравнить структуру субстратов и продуктов; определить тип реакции.

18. Укажите класс и предположительно название ферментов следующих реакций:

а. разрыв связи –С-С-:

глютаминовая кислота ¾¾¾¾® щавелевоуксусная кислота + СО₂

б. образование новой молекулы с использованием АТФ:

пировиноградная кислота + СО₂ +АТФ ¾¾® щавелевоуксусная кислота

в. разрыв связей с присоединением воды:

белок ¾¾® альфа-аминокислоты

г. перенос функциональных групп:

аланин + альфа-кетоглутаровая кислота «пировиноградная кислота+ глютаминовая кислота

д. перенос группы внутри молекулы:

3-фосфоглицериновая кислота ¾¾® 2-фосфоглицериновая кислота

е. альдегид ¾¾® кислота

Аудиторная работа

Лабораторная работа:

1. Влияние температуры на каталитическую активность амилазы слюны. Амилаза слюны катализирует расщепление крахмала через стадию образования декстринов до дисахарида - мальтозы, которая обладает восстанавливающими свойствами.О действии фермента можно судить по исчезновению субстрата амилазы (крахмала) или по образованию конечных продуктов расщепления. Крахмал обнаруживается пробой Люголя (синее окрашивание со свободным иодом).

Об активности фермента можно судить также по обнаружению продуктов реакции. Мальтоза открывается реакцией Троммера (при нагревании с восстанавливающим углеводом гидрат окиси меди восстанавливается сначала в гидрат закиси желтого цвета, затем – в закись меди кирпично-красного цвета).

Ход работы: В четыре пробирки отмерить по 4 мл 0,5%-ого раствора крахмала и по 1 мл слюны, предварительно разведенной в 10 раз водой. 1-ю пробирку (незамедлительно) поместить в кипящую водяную баню, 2-ю – в ледяную, 3-ю - в термостат при 37⁰ С, 4-ю оставить при комнатной температуре. Через 10мин содержимое каждой пробирки разделить на две примерно равные части.

С одной частью провести качественную пробу на крахмал, с другой – на восстанавливающий углевод (пробы Люголя и Троммера соответственно):

а. к содержимому одной пробирки добавить 2 капли раствора Люголя – появление синего окрашивания свидетельствует о наличии крахмала;

б. к содержимому второй пробирки добавить 1 мл 10% -ого раствора едкого калия и по каплям внести 1% -ный раствор сернокислой меди до образования неисчезающего осадка, затеи нагреть до кипения –появление желтого окрашивания, переходящее в кирпично-красное, указывает на наличие восстанавливающего углевода.

Сравнить результаты проб, проведенных при разных температурах и сделать выводы о температурном оптимуме амилазы. Построить график зависимости скорости реакции от температуры.