Определение бактерий группы кишечных палочек БГКП (колиформных бактерий).

Сущность метода.

Метод основан на способности БГКП сбраживать лактозу при высеве в среду Кесслер.

При исследовании сухих продуктов, подвергающиеся различным способам термической обработки перед употреблением (то есть разведение кипяченой водой (85±1)⁰С и выше, доведения до кипения и т.д.), биологически активные добавки (БАД), стерилизованные кисло-молочные (сухие и жидкие), а также пастообразные продукты (в том числе продукты детского питания), а также составляющие их компоненты, определение БГКП проводят без предварительной инкубации.

Сухие продукты, предназначенные для детей с первого дня жизни, а также некоторые виды продуктов функционального питания, употребляемые после восстановления при (37±1)⁰С и (70±1)⁰С, перед посевом должны подвергаться предварительной инкубации в разбавленном фосфатном буферном растворе для восстановления физиологических свойств бактерий, поврежденных в процессе технологической обработки продукта.

 

Посев с предварительной инкубацией сухих молочных продуктов для детского и функционального питания.

Асептически взвешивают 1 г. сухого продукта и вносят в пробирку с

9,0 см³ разбавленного фосфатного буфера для предварительного обогащения. Взвесь тщательно перемешивают, проверяют значение рН при помощи индикаторной бумаги. При необходимости активную кислотность доводят до рН = 7 ед., используя стерильные растворы 1н гидроокиси натрия или 1 н соляной кислоты.

Колбы с исследуемым материалом термостатируют при температуре (37±1)⁰С в течение 24 часов. После чего проводят засев 1,0 см³ проинкубированной взвеси исследуемого продукта в пробирку с 10,0 см³ среды Кесслер лактозой.

Если в исследуемом продукте (прямых посевах или посевах с предварительной инкубацией) отсутствуют признаки роста – газообразование или помутнения среды, дают заключение об отсутствии БГКП (колиформных бактерий). При наличии признаков роста, из колб или пробирок, где наблюдается газообразование или помутнение среды Кесслер с лактозой, производят высев на чашки со средой Эндо или Левина.

 

Прямой посев.

Посев производят микробиологической петлей из каждой пробирки так, чтобы получить рост изолированных колоний. Для этого чашки Петри со средой визуально разбивают по секторам и проводят посевы отдельно на каждый сектор, или на отдельные чашки. Чашки с посевом термостатируют при температуре (37±1)⁰С от 18 до 24 часов.

При определении E. Coli пробирки с исследуемым продуктом в среде Кесслер с лактозой термостатируют при температуре (44±1)⁰С в течении (24±1) часов. А при наличии признаков роста подвергают аналогичному дальнейшему исследованию.

 

Учет результатов.

При отсутствии на среде Эндо или Левина колоний типичных для БГКП (колиформных бактерий) засеянная навеска продукта считается незагрязненной ими, то есть исследуемый продукт соответствует нормативу.

При наличии на средах типичных для БГКП колонии, для делают препараты, окрашивают их по Граму и микроскопируют (см. метод микроскопирования).

 

Типичные колонии БГКП.

Среды	Характеристика БГКП колоний
Эндо   Левина	Красные с металлическим блеском или без него; розовые и бледно-розовые. Черные с металлическим блеском; темные с черным центром; сиреневые с темным центром

 

При обнаружении грамотрицательных не содержащих спор палочек указывает на наличие БГКП (колиформных бактерий) в анализируемой массе продукта и несоответствие продукту микробиологическому нормативу.

Если в результате микроскопирования, подтверждается наличие E. Coli в исследуемом продукте, то все типичные колонии подвергают идентификации по ИМАЦ- тестам (реакция на индол, реакция Фогес – Проскауэра, реакция с метиловым красным, утилизация цитратов).

 

Типичные колонии E. Coli

Среды	Характеристика колоний E. Coli
Эндо   Левина	Красные с металлическим блеском или без него; розовые. Черные темно-коричневые с темным центром, с металлическим блеском или без него.

 

При обнаружении в 10 г. продукта бактерий родов Enterobacter и Citrobacter, но при отсутствии БГКП (колиформных бактерий) в 1 г. продукта, продукт браковке не подлежит.

Обнаружение на среде Эндо колоний с желтым или желто-коричневым оттенком при анализе сухих молочных каш, содержащих в качестве компонента рисовую или гречневую муку, овсяное молоко, манную крупу, указывает на принадлежность выделенных бактерий к роду Erwinia. В этом случае (при отсутствии пигментных микроорганизмов для БГКП) исследуемый продукт считается соответствующий нормативу на БГКП (колиформные бактерии). Так как бактерии рода Erwinia являются представителями эпифитной микрофлоры зерновых культур и не обладают патогенностью для человека. Для идентификации бактерий рода Erwinia, выросших на среде Эндо, их пересевают на питательный агар с 5% сахарозы, на котором они дают мукоидный рост не свойственный БГКП.

 

Метод микроскопирования.

Сущность метода.

Метод основан на просмотре окрашенных препаратов под микроскопом для ориентировочной характеристики морфологии.

 

Проведение анализа.

На чистое предметное стекло наносят микробиологической петлей небольшую каплю исследуемого материала и распределяют на площади приблизительно 1 см². При исследовании пастообразных продуктов или агаровой культуры на стекло наносят каплю стерильной воды, а затем вносят в нее петлей продукт, тщательно перемешивают и растирают на площади 1 см².

Препарат высушивают при комнатной температуре, фиксируют на пламени горелки и красят метиленовым голубым или раствором карболового кристаллического фиолетового (окрашивают по Граму). Далее микроскопируют.