Определение общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

Введение.

 

Курс «Обеспечение безопасности и качества продуктов детского и функционального питания» предусматривает выполнение цикла лабораторных работ по методам исследований (испытаний) качества продуктов детского и функционального питания по микробиологическим показателям безопасности для здоровья человека.

Целью выполнения этих работ является более глубокое изучение методов контроля по микробиологическим показателям безопасности, проводимых в порядке производственного контроля, государственного и ведомственного санитарно-эпидемиологического надзора, а так же при испытаниях указанной продукции в целях сертификации соответствия.

Для оценки качества продуктов детского и функционального питания и их компонентов по микробиологическим показателям безопасности за основу авторами приняты соответствующие стандарты и нормативные документы.

В методических указаниях представлены современные методы микробиологического контроля продуктов детского и функционального питания и их компонентов, применяемые в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, осуществляющих производственный контроль качества при разработке новых видов продуктов детского, лечебного, функционального питания и их компонентов, постановке их на производство и в процессе промышленного выпуска, в лабораториях организаций Госсанэпиднадзора Российской Федерации и ведомственных санитарно-эпидемиологических служб федеральных органов исполнительной власти, а также в лабораториях иных организаций, аккредитованных на право проведения испытаний указанной продукции для целей ее сертификации.

В настоящих методических указаниях авторами предложен для студентов краткий компендиум сведений, полезных при идентификации бактерий.

 

1. Требования к проведению микробиологического контроля.

 

В продуктах детского и функционального питания, а также их компонентах нормируется количество КМАФАМ, микроорганизмов порчи пищевых продуктов – дрожжей и плесневых грибов и В. сеreus в 1 г. продукта, а их содержание выражается количеством колониеобразующих единиц – КОЕ/г.

Другие группы микроорганизмов: БГКП (колиформы), Е. coli,

S. aureus, Salmonella в определенной массе продукта не допускается.

В продуктах содержащих специфическую микрофлору КМАФАМ не определяют, так как подсчет бактерий в таких случаях не может быть показательным.

Контроль специфической микрофлоры кисло-молочных продуктов, ³продуктов функционального питания (ФП), содержащих данную микрофлору, осуществляется в соответствии с методами по определению жизнеспособных клеток бифидо- и/или ломбобактерий, ацидофильных бактерий.

Закваски контролируют в соответствии с действующими нормативными документами, те есть на отсутствие условно- патогенных и патогенных микроорганизмов в определенном объеме продукта: Saureus – в 10 см³ закваски, Salmonella – в 100 см³ закваски.

Микробиологический контроль включает способы дифференциации сапрофитных микроорганизмов рода Erwinia от БГКП, при исследовании продуктов на зерновой основе по выявлению БГКП (колиформы).

Стерилизованные продукты должны отвечать требованиям промышленной стерильности.

При обнаружении повышенного содержания КМАФАМ в продуктах детского питания определяется количественное содержание и энтерококков.

В производственных лабораториях предприятий по выпуску продуктов детского питания, микробиологическому контролю подлежит каждая партия готового продукта и компонентов на содержание КМАФАМ, БГКП, дрожжей и плесневых грибов. А контроль за содержанием стафилококков и B. сereus в сухих продуктах и их компонентах проводится не реке одного раза в месяц.

Контроль на отсутствие патогенных микроорганизмов, в том числе Salmonella проводят аккредитованные лаборатории Центров Госсанэпиднадзора.

 

2. Методы отбора проб сырья, компонентов и готовой продукции.

Отбор проб осуществляется в соответствии с ГОСТ 26809.«Молоко и молочные продукты. Отбор проб и подготовка к испытанию»;

ГОСТ 13928 «Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки,

методы отборы и подготовка проб к анализу»;

ГОСТ 9225 «Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа»;

ГОСТ 26668 «Продукты пищевые и вкусовые. Порядок отбора проб для микробиологических анализов»;

ГОСТ 26972 «Зерно, крупа, мука, только для продуктов детского питания. Методы микробиологического анализа».

МУК 4.2.577 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов».

Посуду с пробой или пробу в потребительской упаковке снабжают этикеткой на которой указывают:

- номер пробы;

- наименование продукта;

- номер и объем партии;

- дату и час отбора пробы.

Обозначения действующей нормативной документации по которой вырабатывают продукт.

Микробиологические анализы продукта проводят не более чем через 4 часа с момента отбора проб.

Пробы должны храниться до начала исследований при температуре продукта не выше 6⁰С.

 

 

3. Подготовка проб к анализу.

 

Отобранные средние пробы сухих продуктов для детского, функционального питания и их компонентов тщательно перемешивают, взвешивают навеску продукта на стерильной чашке Петри, затем переносят ее в стерильную колбу или другую стерильную посуду.

Отобранные средние пробы консервов для детского и функционального питания тщательно перемешивают. Перед вскрытием консервной тары с продуктом крышку протирают ватой, смоченной спиртом. Открывают крышку фламбированным консервным ножом. После снятия крышки края консервной тары вновь фламбируют.

Отобранные пробы молока, сливок и других жидких продуктов перед исследованием тщательно перемешивают.

Пробы кисло-молочных продуктов и напитков, а также заквасок перед исследованием перемешивают и нейтрализуют каждые 10 см ³ исследуемого продукта 1,0 см³ стерильного раствора двууглекислого натрия с массовой концентрацией 100 г/дм³, для сухих кисло-молочных продуктов нейтрализуют каждые 10 см³ первого разведения продукта, затем все тщательно перемешивают.

Пробы сгущенных продуктов и их компонентов перемешивают стерильной ложкой, затем взвешивают стерильную сухую колбу и в нее помещают 10 г продукта.

Навеску сыра, творога, творожных изделий и пастообразных продуктов взвешивают в стерильной чашке Петри, после чего переносят в стерильную или фламбированную ступку, прикрытую крышкой от чашки Петри, тщательно растирают и нейтрализуют каждые 10 см ³ исследуемого продукта 1,0 см³ стерильного раствора двууглекислого натрия с массовой концентрацией 100 г/дм³.

Пробу топленого масла или молочного жира расплавляют в водяной бане при температуре от 40 до 45⁰С и перемешивают до получения однородной эмульсии.

 

 

4. Приготовление разведений продуктов для посева

 

Перед посевом готовят десятикратные разведения продукта в стерильных раствора разбавленного фосфатного буфера, изотонического раствора натрия хлорида (физраствор).

Для приготовления разведений готовят необходимые стерильные материалы и посуду в соответствии со спецификой анализа исследуемого продукта: пробирки с 9,0 см³ или колбы с 90,0 см³ одного из растворов, используемых для приготовления разведений. Из жидких проб продукта отбирают стерильной пипеткой 10,0 см³ и вносят в 90,0 см³ одного из стерильных растворов, используемых для приготовления разведений, взбалтывают в течение 5 мин круговыми движениями до более полного растворения. При этом пипетку промывают до 10 раз раствором этого же продукта до верхнего уровня,имеющейся на ней делений. Таким образом получают первое разведение 1:10.

Из сухих проб продукта (сухие молочные продукты, сывороточные белки концентратов, казецитов и других компонентов, а так же пастообразных продуктов) отбирают навески по 10г, и переносят в колбу с 90,0 см³ одного из стерильных растворов, используемых для приготовления разведений, подогретых от 40 до 45 ⁰С и взбалтывают в течение (4±1) мин круговыми движениями до возможно более полного эмульгирования. Получают разведение 1:10.

При разведении продуктов не на молочной основе, навески по 1 г переносят в пробирку, добавляя 9,0 см³ физраствора. Для получения однородной взвеси продукта допускается перемешивание в аппарате для встряхивания жидкостей в течение (6±1) мин, избегая намокания пробок.

Из первого разведения продукта стерильной пипеткой берут 1,0 см³ и переносят в пробирку, содержащую 9,0 см³ стерильного раствора, используемого лоя приготовления разведений, перемешивают осторожно, набирая и выдувая из пипетки по 5-10 раз. Получают второе разведение продукта 1:100. Последующие разведения в зависимости от предполагаемого обсеменения продукта 1:1000, 1:10000 и т.д. готовят аналогично.

 

Для приготовления каждого разведения берут новую стерильную пипетку, Вводят пипетку в пробирку не более, чем на 2-3 см ниже поверхности взвеси.

Время от момента приготовления разведений до посева не должно превышать 20-30 мин. Перед посевом все разведения осторожно встряхивают. При посеве на чашки Петри или в пробирки посевной материал вносят от большего разведения к меньшему. В этом случает пользуются одной пипеткой.

Для приготовления разведений сухих молочных каш для детского питания используют надосадочную жидкость первого разведения продукта после отстаивания его в течение 2-3- мин.

 

 

5. Методы анализа продуктов детского и функционального питания.

Контроль микробиологического качества и безопасности продуктов детского и функционального питания выделяет следующие группы микроорганизмов: КМАФАМ – общее количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, бактерий группы кишечных палочек (БГКП) колиформы, Е. coli, S. aureus, B. cereus, бактерии рода Salmonella, дрожжи и плесневые грибы.

В кисло-молочных продуктах, а также продуктах функционального питания, содержащих в своем составе пробиотическую микрофлору проводится контроль за количеством технологически значимой микрофлоры: молочно-кислые бактерии, бифидобактерии.

При проведении посевов на индикаторные, условно-патогенные и патогенные микроорганизмы должны быть использованы контрольные культуры соответствующих микроорганизмов, которые изучают в тестах идентификации параллельно с культурами, выделенными из исследуемых образцов продуктов.

 

 

Лабораторная работа № 1

Семейство Streptococcaclae.

Род Streptococcus.

Клетки от сферических до овальных, менее 2 мкм в диаметр (размеры варьируются в зависимости от вида). Встречаются в парах или цепочках, когда растут в жидкой среде. Грамположительны. Метаболизм бродильный, преобладающий конечный продукт при сбраживании глюкозы – молочная кислота. Гомоферментативные. Некоторые виды сбраживают органические кислоты (яблочную, лимонную) и аминокислоты (серин, аргинин).

Факультативные анаэробы. В присутствии кислорода может накапливаться перекись водорода. Температурный оптимум 37⁰С. Максимальная и минимальная температуры могут варьироваться в зависимости от вида.

Виды стрептококков: S. pyogenes (типовой вид), S. equisimilis, S. bovis, S. mitis, S. avium, S. lactis, S. cremoris, S. acidominimus, S. thermophilus и другие виды.

Энтерококки – грамположительные кокки, в мазках из жидких сред располагаются в виде коротки или длинных цепочек; в плотных – в виде скоплений кокков. Растут в бульонах с 40% желчи и при активной кислотности (9,9 ±0,3) ед. рН, не разлагают перекись водорода, так как не вырабатывают фермент каталазу. Обнаружение их в продукте свидетельствует о контроле за технологией процессов, проведения санитарной обработки технологического оборудования.

При санитарно – гигиенической характеристике продукта, численность микроорганизмов (МАФАМ) в продукте выражают в КОЕ/г (см³) с указанием соответствия или несоответствия продукта микробиологическому нормативу.

 

Сущность метода.

 

Метод основан на количественном подсчете колоний микроорганизмов, вырастающих на плотном питательном агаре при температуре (30±1)⁰С в течение 72 часов.

 

Методика определения.

Для определения КМАФАМ выбирают те разведения, при посеве которых на чашках вырастает не менее 15 и не более 300 колоний.

При посеве продуктов, не требующих разведения, учитывают все выросшие на чашках колонии (то есть не менее 15).

 

Посев на чашки Петри.

Перед посевом чашки маркируют. На дне чашки по стеклу ставят номер образца, разведение и дату.

По 1 см³ соответствующего разведения или цельного продукта вносят в две чашки Петри для параллельного определения. Затем наливают в каждую чашку по 15-20 см³ расплавленной питательной среды, температурой 45⁰С. Края колб с питательной средой перед каждой заливкой фламбируют в пламени спиртовки. После заливки среды чашки тщательно перемешивают путем вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала и оставляют для остывания.

 

Инкубация.

После застывания среды чашки Петри переворачивают крышками вниз и помещают в таком виде в термостат при (30±1)⁰С на 72 часа.

 

Род Esherichia.

Прямые палочки 1,1 – 1,5 * 2,0 – 6,0 мкм (живые) или 0,4 – 0,7 * 1,0 – 3,0 мкм (высушенные и окрашенные). Встречаются отдельно или в парах. Подвижные или неподвижные.

Хорошо растут на простых питательных средах.

Морфология колонии:

На питательном агаре могут быть гладкими, слабовыпуклые, влажные с блестящей поверхностью, с ровным краем, сероватые или шероховатые и сухие. Могут встречаться слизистые формы.

В качестве источника углерода используется ацетат. Глюкоза и другие углеводы сбраживаются с образованием пирувата, который затем превращается в молочную, уксусную и муравьиную кислоты. Некоторые штаммы не газообразующие. Лактоза сбраживается большинством штаммов.

Типовой вид: Escherichia coli.

Род Citrobacter.

Подвижные палочки. Хорошо растут на обычных средах, могут использовать цитрат, как единственный источник углерода. Глюкозу и другие углеводы сбраживают с образованием кислоты и газа (СО₂ и Н₂ в соотношении 1:1).

Лактозу иногда не сбраживают.

Способны расти в тетратионатном бульоне Мюллера, селенитном бульоне Лейфсона, Na – дезоксихолатно-цитратном агаре, среде Уилсона и Блэра, агаре с бриллиантовым зеленым или феноловым красным.

Данные среды ингибируют или замедляют рост Е. coli.

Являются обычными представителями кишечной микрофлоры человека.

Определенные серотипы встречаются при массовых пищевых токсикоинфекциях, инфекциях среднего уха, мозговых оболочек и т.д.

Типовой вид: Citrobacter freundii.

 

 

Род Enterobacter.

 

Подвижные палочки. Могут использовать цитрат и ацетат в качестве единственного источника углерода. При 37⁰С сбраживают глюкозу с образованием кислоты и газа (СО₂: Н₂ = 2:1). При 44,5⁰С газ из глюкозы не образуется. Тест с метиловым красным – отрицательный. Большинство штаммов медленно разжижают желатин.

Типовой вид: Enterobacters cloacae.

 

Род Serratia.

 

Подвижные палочки. Могут использовать цитрат и ацетат в качестве единственного источника углерода. Многие штаммы образуют розовый, красный или фуксиновый пигмент.

Глюкозу сбраживают с выделением небольшого количества газа или без его образования. Тест с метиловым красным – отрицательный.

Типовой вид: Serratia marcecens.

Род Klebsiella.

Неподвижные палочки, 0,3 – 1,5 * 0,6 – 6,0 мкм, одиночные, в парах или коротких цепочках. Растут на средах с мясным экстрактом.

Морфология колоний: куполообразные блестящие колонии различной степени липкости в зависимости от штамма и состава среды.

В качестве единственного источника углерода может использоваться цитрат и глюкоза, а аммиак – как источник азота.

Глюкоза сбраживается с образованием кислоты и газа (СО₂ больше чем Н₂). Оптимальная температура роста 35-37⁰С, рН оптимум около 7,2. Штаммы Klebsiella устойчивы к пенициллину в стандартных дозах, но к высоким концентрациям могут быть чувствительны. Чувствительны к ампициллину, стрептомицину, тетрациклину, неомицину, канамицину и др.

Типовой вид: Klebsiella pneumoniae.

 

Лабораторная работа № 2.

Сущность метода.

Метод основан на способности БГКП сбраживать лактозу при высеве в среду Кесслер.

При исследовании сухих продуктов, подвергающиеся различным способам термической обработки перед употреблением (то есть разведение кипяченой водой (85±1)⁰С и выше, доведения до кипения и т.д.), биологически активные добавки (БАД), стерилизованные кисло-молочные (сухие и жидкие), а также пастообразные продукты (в том числе продукты детского питания), а также составляющие их компоненты, определение БГКП проводят без предварительной инкубации.

Сухие продукты, предназначенные для детей с первого дня жизни, а также некоторые виды продуктов функционального питания, употребляемые после восстановления при (37±1)⁰С и (70±1)⁰С, перед посевом должны подвергаться предварительной инкубации в разбавленном фосфатном буферном растворе для восстановления физиологических свойств бактерий, поврежденных в процессе технологической обработки продукта.

 

Посев с предварительной инкубацией сухих молочных продуктов для детского и функционального питания.

Асептически взвешивают 1 г. сухого продукта и вносят в пробирку с

9,0 см³ разбавленного фосфатного буфера для предварительного обогащения. Взвесь тщательно перемешивают, проверяют значение рН при помощи индикаторной бумаги. При необходимости активную кислотность доводят до рН = 7 ед., используя стерильные растворы 1н гидроокиси натрия или 1 н соляной кислоты.

Колбы с исследуемым материалом термостатируют при температуре (37±1)⁰С в течение 24 часов. После чего проводят засев 1,0 см³ проинкубированной взвеси исследуемого продукта в пробирку с 10,0 см³ среды Кесслер лактозой.

Если в исследуемом продукте (прямых посевах или посевах с предварительной инкубацией) отсутствуют признаки роста – газообразование или помутнения среды, дают заключение об отсутствии БГКП (колиформных бактерий). При наличии признаков роста, из колб или пробирок, где наблюдается газообразование или помутнение среды Кесслер с лактозой, производят высев на чашки со средой Эндо или Левина.

 

Прямой посев.

Посев производят микробиологической петлей из каждой пробирки так, чтобы получить рост изолированных колоний. Для этого чашки Петри со средой визуально разбивают по секторам и проводят посевы отдельно на каждый сектор, или на отдельные чашки. Чашки с посевом термостатируют при температуре (37±1)⁰С от 18 до 24 часов.

При определении E. Coli пробирки с исследуемым продуктом в среде Кесслер с лактозой термостатируют при температуре (44±1)⁰С в течении (24±1) часов. А при наличии признаков роста подвергают аналогичному дальнейшему исследованию.

 

Учет результатов.

При отсутствии на среде Эндо или Левина колоний типичных для БГКП (колиформных бактерий) засеянная навеска продукта считается незагрязненной ими, то есть исследуемый продукт соответствует нормативу.

При наличии на средах типичных для БГКП колонии, для делают препараты, окрашивают их по Граму и микроскопируют (см. метод микроскопирования).

 

Типичные колонии БГКП.

Среды	Характеристика БГКП колоний
Эндо   Левина	Красные с металлическим блеском или без него; розовые и бледно-розовые. Черные с металлическим блеском; темные с черным центром; сиреневые с темным центром

 

При обнаружении грамотрицательных не содержащих спор палочек указывает на наличие БГКП (колиформных бактерий) в анализируемой массе продукта и несоответствие продукту микробиологическому нормативу.

Если в результате микроскопирования, подтверждается наличие E. Coli в исследуемом продукте, то все типичные колонии подвергают идентификации по ИМАЦ- тестам (реакция на индол, реакция Фогес – Проскауэра, реакция с метиловым красным, утилизация цитратов).

 

Типичные колонии E. Coli

Среды	Характеристика колоний E. Coli
Эндо   Левина	Красные с металлическим блеском или без него; розовые. Черные темно-коричневые с темным центром, с металлическим блеском или без него.

 

При обнаружении в 10 г. продукта бактерий родов Enterobacter и Citrobacter, но при отсутствии БГКП (колиформных бактерий) в 1 г. продукта, продукт браковке не подлежит.

Обнаружение на среде Эндо колоний с желтым или желто-коричневым оттенком при анализе сухих молочных каш, содержащих в качестве компонента рисовую или гречневую муку, овсяное молоко, манную крупу, указывает на принадлежность выделенных бактерий к роду Erwinia. В этом случае (при отсутствии пигментных микроорганизмов для БГКП) исследуемый продукт считается соответствующий нормативу на БГКП (колиформные бактерии). Так как бактерии рода Erwinia являются представителями эпифитной микрофлоры зерновых культур и не обладают патогенностью для человека. Для идентификации бактерий рода Erwinia, выросших на среде Эндо, их пересевают на питательный агар с 5% сахарозы, на котором они дают мукоидный рост не свойственный БГКП.

 

Метод микроскопирования.

Сущность метода.

Метод основан на просмотре окрашенных препаратов под микроскопом для ориентировочной характеристики морфологии.

 

Проведение анализа.

На чистое предметное стекло наносят микробиологической петлей небольшую каплю исследуемого материала и распределяют на площади приблизительно 1 см². При исследовании пастообразных продуктов или агаровой культуры на стекло наносят каплю стерильной воды, а затем вносят в нее петлей продукт, тщательно перемешивают и растирают на площади 1 см².

Препарат высушивают при комнатной температуре, фиксируют на пламени горелки и красят метиленовым голубым или раствором карболового кристаллического фиолетового (окрашивают по Граму). Далее микроскопируют.

 

 

Вопросы для самопроверки.

1. Характеристика семейства Enterobacteriaclae. Характеристика родов группы БГКП.

2. Сущность метода определения БГКП.

3. Приготовление разведений продуктов для посев. Какие виды посевов существуют при определении БГКП впродуктах детского и функционального питания?

4. Морфология колоний БГКП, E. Coli на средах Эндо и Левина.

5. Сущность метода микроскопирования.

 

 

Лабораторная работа № 3

Сущность метода.

Метод основан на количественном подсчете числа колоний дрожжей и плесневых грибов, вырастающих на плотных питательных средах с антибиотиками при температуре (24±1)⁰С в течение 5 суток при посеве исследуемого продукта.

 

Методика определения.

Из каждой пробы используемого продукта делают посев по 1,0 см³ разведений 1:10; 1:100 на две чашки Петри со средой Сабуро. Чашки Петри должны быть заранее промаркированы и залиты охлажденной до 45⁰С средой в количестве 14,0 см³. После высева разведений продукта на среду, чашки закрывают крышками и тщательно перемешивают, оставляя для застывания при комнатной температуре.

Затем их термостатируют при температуре (24±1) ⁰С в течение 120 часов, предварительным учетом через 70 часов. Количество колоний дрожжей и плесневых грибов подсчитывают раздельно.

Колонии дрожжей имеют беловато-желтый цвет, сметанообразующую консистенцию, перламутровый оттенок и куполообразное возвышение.

Колонии плесневых грибов имеют пушистый мицелий, напоминающий вату. Окраска варьирует.

Для количества подсчета отбирают чашки на которых выросло от 15 до 150 колоний дрожжей и/или от 5 до 50 колоний плесневых грибов.

При необходимости проводят микроскопирование.

 

Вопросы для самопроверки.

1. Какие виды плесневых грибов и семейства дрожжей наиболее часто встречаются в пищевых продуктах?

2. Характеристика групп микроорганизмов, вызывающих порчу пищевых продуктов.

3. Сущность метода определения количества дрожжей и плесневых грибов.

4. В каких случаях проводят повторные микробиологические анализы с удвоенным содержанием образцов?

5. Какие санитарно – гигиенические требования предъявляют к предприятиям по производству продуктов детского питания?

 

 

Род Lactobacterium.

 

Прямые и изогнутые грамположительные палочки длинной от 0,7 до 3,0 мкм, расположенные беспорядочными скоплениями и отдельными короткими цепочками. Жгутиков не имеют. Капсул и спор не образуют. Анаэробы и факультативные анаэробы. Становятся грамотрицательными при повышении кислотности.

У некоторых штаммов выявляются зернистость содержимого клетки или полосатость при окраске по Граму или метиловым синим.

Метаболизм – бродильный, хотя могут расти на воздухе, некоторые - ------ анаэробы.

Характерная черта – способность расщеплять сахара; при сбраживании глюкозы рН снижается на одну и более единиц. Поверхностный рост усиливается на твердых средах при анаэробиозе и 5-10% СО₂. Температурные пределы: 15-45⁰С. Кислотолюбивые, рН 5,5 – 5,8 и менее растут при рН = 5,0. Тип молочнокислого брожения. Сбраживают рибозу. Образуют D-L – молочную кислоту из глюкозы.

Гомоферментативные растут при 45⁰С, не растут при 20⁰С и ниже:

L. delbruecbii; L. leichmannii; L. jensenii; L. lactis; L. bulgaricus;

L. helveticus; L. acidophilus; L. plantarum; L. casei; L.curvatus; L. casei subst. preudoplantarum.

Не вызывают газа из глюкозы, рибозу не сбраживают, образуют D-L- молочную кислоту.

 

Гетероферментативные – из глюкозы образуют молочную кислоту со значительным количеством СО₂, уксусной кислоты и этанола; из фруктозы – манит.

L. fermentum – рост при 45⁰С, нет роста при 15⁰С.

L. cellobiosus – рост и при 45⁰С, и при 15⁰С.

 

Не растут при 45 ⁰С, рост наблюдается при 15⁰С: L. brevis; L. buchneri;

L. coprophilus; L. viridescens.

 

Лабораторная работа № 4.

Сущность метода.

Метод основан на способности бифидобактерий расти в питательных средах, разлитым высоким столбиком в пробирках при температуре (37±1) ⁰С и образовывать в них через 24 – 72 часа гвоздикообразные характерные колонии.

 

Методика определения.

Готовят десятикратные разведения продукта. Причем, перемешивание продукта производят способом, исключающим попадание воздуха в пробирку.

Перед посевом разведений, среды в пробирках следует разогреть в кипящей водяной бане до полного расплавления агара и появления на поверхности пузырьков. Далее выдержать их в течение 20 минут, а перед посевом остудить до температуры 45⁰С, погружением в холодную воду.

Из приготовленных разведений исследуемого продукта делают посевы по 1,0 см³ в два параллельных ряда пробирок с питательной средой. Для каждого посева (пробирки) берут отдельную пипетку.

 

Инкубация.

 

Посевы выдерживают в термостате при температуре (37±1) ⁰С в течение (72±1) часов.

 

 

Лабораторная работа № 5.

Сущность метода.

Метод основан на высеве определенных разведений исследуемого продукта из физиологического раствора в среду МРС – 4, культивирование посевов при оптимальных условиях и, при необходимости, определения морфологических свойств обнаруженных микроорганизмов, а так же их подсчете.

 

Методика определения.

Для определения жизнеспособных клеток 1,0000 г или см³ исследуемого продукта растворяют в колбе вместимостью 250 см³ в 100 см³ 0,9%-ного раствора хлорида натрия и перемешивают путем встряхивания суспензии в течение 5 минут. Таким образом, получают разведение биомассы 10^-2. Из 2-го разведения (10^-2) образца стерильной пипеткой переносят 1см³ суспензии в пробирку с 9 см³ 0,9 %-ного раствора хлорида натрия, тщательно перемешивают, набирая раствор из пипетки от 5 до 10 раз. Таким образом, получают третье разведение (10^-3) исследуемого образца. Эту операцию повторяют до получения требуемого разведения.

При приготовлении разведений используют каждый раз отдельно взятую стерильную пипетку, вводя ее в пробирку выше уровня ее дна от 2 до 3 см. Время от момента приготовления разведения до посева не должно превышать 30 минут.

 

Посев на чашки Петри

Перед посевом маркируют 4 чашки Петри, используемые для параллельных определений. На каждые 2 чашки карандашом по стеклу ставят номер разведения и дату посева.

Для посева используют два параллельных ряда чашек Петри со средой МРС-4, предварительно подготовленных по ГОСТ 26670.

Из 2-х последних разведений образцов на поверхность питательной среды наносят в каждом случае отдельной, стерильной пипеткой по 0,1 см³ микробной суспензии. Пипетку с посевным материалом держат под углом 45⁰. Затем микробную суспензию растирают шпателем Дригальского по поверхности питательной среды.

Посевы термостатируют при температуре (37±1)⁰С в течение (44±4) ч.

 

Вопросы для самопроверки

1. Что означает термин «пробиотики»?

2. Характеристика рода Bifidobacterium, рода Lactobacterium.

3. Сущность методов определения бифидобактерий, лактобактерий. Сравнительная характеристика.

4. Перечислите оптимальные условия культивирования посевов при определении Lactobacterium и Bifidobacterium.

5. Какие питательные среды применяют для культивирования посевов при определении бифидобактерий в продуктах на молочной и немолочной основах.

 

 

Содержание.

Введение…………………………………………………………………2

 

Основные требования к проведению

микробиологического контроля………………………………………..3

 

Методы отбора проб сырья,

компонентов и готовой продукции………………………………….....4

 

Подготовка проб к анализу …………………………………………….4

 

Приготовление разведений

продуктов для посева……………………………………………………5

 

Методы анализа продуктов детского

и функционального питания…………………………………………….6

 

Лабораторная работа № 1

Определение КМАФАМ………………………………………………...7

 

Лабораторная работа № 2

Определение БГКП (колиформных

бактерий)…………………………………………………………………12

 

Лабораторная работа № 3

Определение количества дрожжей

и плесневых грибов……………………………………………………...17

 

Лабораторная работа № 4

Определение количества жизнеспособных

клеток бифидобактерий………………………………………………….22

 

Лабораторная работа № 5

Определение жизнеспособных

клеток лактобацилл………………………………………………………23

 

Методика определения содержания

бифидобактерий в смешанных с

молочно-кислыми бактериями в продуктах…………………………….25

 

Список питательных сред………………………………………………..27

 

Литература………………………………………………………………...29

Введение.

 

Курс «Обеспечение безопасности и качества продуктов детского и функционального питания» предусматривает выполнение цикла лабораторных работ по методам исследований (испытаний) качества продуктов детского и функционального питания по микробиологическим показателям безопасности для здоровья человека.

Целью выполнения этих работ является более глубокое изучение методов контроля по микробиологическим показателям безопасности, проводимых в порядке производственного контроля, государственного и ведомственного санитарно-эпидемиологического надзора, а так же при испытаниях указанной продукции в целях сертификации соответствия.

Для оценки качества продуктов детского и функционального питания и их компонентов по микробиологическим показателям безопасности за основу авторами приняты соответствующие стандарты и нормативные документы.

В методических указаниях представлены современные методы микробиологического контроля продуктов детского и функционального питания и их компонентов, применяемые в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, осуществляющих производственный контроль качества при разработке новых видов продуктов детского, лечебного, функционального питания и их компонентов, постановке их на производство и в процессе промышленного выпуска, в лабораториях организаций Госсанэпиднадзора Российской Федерации и ведомственных санитарно-эпидемиологических служб федеральных органов исполнительной власти, а также в лабораториях иных организаций, аккредитованных на право проведения испытаний указанной продукции для целей ее сертификации.

В настоящих методических указаниях авторами предложен для студентов краткий компендиум сведений, полезных при идентификации бактерий.

 

1. Требования к проведению микробиологического контроля.

 

В продуктах детского и функционального питания, а также их компонентах нормируется количество КМАФАМ, микроорганизмов порчи пищевых продуктов – дрожжей и плесневых грибов и В. сеreus в 1 г. продукта, а их содержание выражается количеством колониеобразующих единиц – КОЕ/г.

Другие группы микроорганизмов: БГКП (колиформы), Е. coli,

S. aureus, Salmonella в определенной массе продукта не допускается.

В продуктах содержащих специфическую микрофлору КМАФАМ не определяют, так как подсчет бактерий в таких случаях не может быть показательным.

Контроль специфической микрофлоры кисло-молочных продуктов, ³продуктов функционального питания (ФП), содержащих данную микрофлору, осуществляется в соответствии с методами по определению жизнеспособных клеток бифидо- и/или ломбобактерий, ацидофильных бактерий.

Закваски контролируют в соответствии с действующими нормативными документами, те есть на отсутствие условно- патогенных и патогенных микроорганизмов в определенном объеме продукта: Saureus – в 10 см³ закваски, Salmonella – в 100 см³ закваски.

Микробиологический контроль включает способы дифференциации сапрофитных микроорганизмов рода Erwinia от БГКП, при исследовании продуктов на зерновой основе по выявлению БГКП (колиформы).

Стерилизованные продукты должны отвечать требованиям промышленной стерильности.

При обнаружении повышенного содержания КМАФАМ в продуктах детского питания определяется количественное содержание и энтерококков.

В производственных лабораториях предприятий по выпуску продуктов детского питания, микробиологическому