Двойное оплодотворение у цветковых растений: Оплодотворение - это процесс слияния мужской и женской половых клеток с образованием зиготы...
Эмиссия газов от очистных сооружений канализации: В последние годы внимание мирового сообщества сосредоточено на экологических проблемах...
Топ:
Техника безопасности при работе на пароконвектомате: К обслуживанию пароконвектомата допускаются лица, прошедшие технический минимум по эксплуатации оборудования...
Особенности труда и отдыха в условиях низких температур: К работам при низких температурах на открытом воздухе и в не отапливаемых помещениях допускаются лица не моложе 18 лет, прошедшие...
История развития методов оптимизации: теорема Куна-Таккера, метод Лагранжа, роль выпуклости в оптимизации...
Интересное:
Что нужно делать при лейкемии: Прежде всего, необходимо выяснить, не страдаете ли вы каким-либо душевным недугом...
Как мы говорим и как мы слушаем: общение можно сравнить с огромным зонтиком, под которым скрыто все...
Уполаживание и террасирование склонов: Если глубина оврага более 5 м необходимо устройство берм. Варианты использования оврагов для градостроительных целей...
Дисциплины:
2017-11-27 | 1052 |
5.00
из
|
Заказать работу |
|
|
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - реакция матричного синтеза, в ходе которой происходит многократное копирование (амплификация) тестируемого участка ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов.
Разработке методики ПЦР сопутствовало развитие некоторых технологий. В частности, появление приборов, позволяющих автоматически синтезировать короткие одноцепочечные фрагменты ДНК - олигонуклеотиды, а также открытие термофильных микроорганизмов, живущих в горячих источниках (гейзерах). Ферментативная система экстремальных термофилов способна функционировать при высоких температурах. ДНК-полимераза этих организмов выдерживает многократное повышение температуры до 95˚С без потери биологической активности, что является необходимым условием для проведения ПЦР.
Итогом этого стала разработка сотрудником фирмы "Cetus" Кэри Мюллисом в 1983 г. полимеразной цепной реакции, за которую он в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии.
Особенно бурное развитие метод ПЦР получил в связи с программой "Геном человека", так как он позволил модифицировать методику секвенирования и ускорить процесс расшифровки последовательностеи ДНК.
Механизм ПЦР.
Компоненты реакционной смеси.
а. Праймеры - искусственно синтезированные олигонуклеотиды, состоящие как правило из 15-30 нуклеотидов, комплементарные 3'-концам анализируемых участков ДНК. Они являются начальными участками фрагментов ДНК, подлежащих амплификации. Обычно вводится два праймера, один из которых комплементарен началу одной цепи, другой - концу второй цепи.
б. Смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (дНТФ) - дезоксирибоаденозинтрифосфата (дАТФ), дезоксирибогуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксириботимидинтрифосфата, (дТТФ) дезоксирибоцитидинтрифосфат (дЦТФ) - являющаяся материалом для синтеза новых цепей.
|
в. Taq-ДНК-полимераза - термостабильный фермент, выделенный из экстремально термофильной бактерии Thermus aquaticus, обеспечивающий матричный синтез 3'-конца второй цепи ДНК по принципу комплементарности.
г. Реакционный буфер - смесь стабилизаторов, катионов и анионов, обеспечивающий оптимальные условия функционирования полимеразы.
д. Анализируемый образец - препарат ДНК, предположительно содержащий искомую нуклеотидную последовательность, подлежащую амплификации.
Этапы амплификации
Температурный цикл состоит из трех этапов:
1. Термическая денатурация (плавление цепей).
Анализируемый образец представлен двухцепочечной молекулой ДНК, а для проведения требуются одноцепочечные фрагменты. Для этого реакционная смесь нагревается до 92-95˚С, в результате происходит разрушение водородных связей между нуклеотидами и разделение цепей.
2. Отжиг праймеров.
При снижении температуры до 50-60˚С происходит присоединение праймеров к одноцепочечным фрагментам ДНК. Отжиг происходит в соответствии с правилом Чаргаффа и принципом комплементарности, то есть если нуклеотидная последовательность праймера комплементарна последовательности анализируемой цепи, то отжиг произойдет, если некомплементарна – нет.
3. Элонгация (синтез цепей).
На этом этапе температура смеси доводится до 72˚С, что является оптимумом для функционирования фермента Taq-ДНК-полимеразы, при этом синтез второй цепи идет с максимальной эффективностью и точностью.
Указанные этапы составляют один температурный цикл. В ходе ПЦР проводится до 30-35 циклов, что позволяет получить из одного участка ДНК до миллиона копий.
Важным событием явилось создание приборов-амплификаторов (термоциклеров), которые в автоматическом режиме, по специальной программе, осуществляют высокоточное регулирование температуры реакционной смеси и проводят ПЦР за 3-5 часов.
|
После открытия термостабильной РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ревертазы, обратной транскриптазы) появилась возможность диагностики многих заболеваний, вызываемых РНК-содержащими вирусами (вирус гепатита С, пикорнавирусы, и др.).
Области применения ПЦР.
В настоящее время наиболее быстро развиваются шесть основных направлений ПЦР-диагностики.
1. Диагностика инфекционных заболеваний.
Это связано с тем, что в отличие от ИФА и других методов определения антигенов возбудителя, ДНК-диагностика позволяет непосредственно идентифицировать возбудителя заболевания по его геному.
2. Диагностика онкологических заболеваний.
После открытия онкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста и исследований ученых в рамках проекта "Геном человека" появилась возможность определения активности этих генов и, тем самым, указывать на предрасположенность и даже наличие онкологического заболевания у обследуемого субъекта.
3. Диагностика генетических заболеваний.
В настоящее время разработаны тест-системы диагностики большого количества генетических заболеваний, например, муковисцидоза, миодистрофии Дюшенна-Беккера и др.
4. Идентификация личности.
Определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов является индивидуальной особенностью каждого человека (см. ПДРФ).
5. Определение генетической структуры главного комплекса гистосовместимости (HLA).
Представляет особую ценность при трансплантации органов и тканей, так как различие в структуре антигенов гистосовместимости, определяемое генетически, лежит в основе реакции отторжения трансплантата.
6. Диагностика патогенов в пище.
Эта отрасль ДНК-диагностики является пока самой скромной среди представленных, однако является перспективной, так как методы являются более точными, быстрыми и информативными.
|
|
История создания датчика движения: Первый прибор для обнаружения движения был изобретен немецким физиком Генрихом Герцем...
Археология об основании Рима: Новые раскопки проясняют и такой острый дискуссионный вопрос, как дата самого возникновения Рима...
Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого...
Адаптации растений и животных к жизни в горах: Большое значение для жизни организмов в горах имеют степень расчленения, крутизна и экспозиционные различия склонов...
© cyberpedia.su 2017-2024 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав. Мы поможем в написании вашей работы!