Особенности клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий

Признак и компоненты	Грамположительные	Грамотрицательные
1. Структура	однородная	слоистая
2. Толщина	20 – 60нм	14 – 18 нм
3. Ригидный и пластичный	связаны ковалентно	связаны лабильно
4. Пептидогликан	до 90% сухой массы, предст. 5 – 6 слоями, часто не содержит диаминопимелиновую кислоту	до 5 – 10% сухой массы предст. 1 – 2 слоями, содержит диаминопимелиновую кислоту
5. Тейховые кислоты	до 50% сухой массы	отсутствуют
6. Наружная мембрана	у некоторых имеются токсические гликолипиды; липополисахариды отсутствуют	представлена липопротеинами, фосфолипидами, липополисахаридами
7. Белки	белки, определяющие антигенную специфичность	белки – порины
8. Чувствительность к пенициллинам и лизоциму	высоко чувствительна	менее чувствительна
Представители	бациллы, клостридии, коринебактерии, стафилококки, стрептококки, пептококки	энтеробактерии, вибрионы, нейссерии, вейлонеллы, бактероиды, спириллы, псевдомонады

 

Цитоплазматическая мембрана является полифункциональной структурой. Выполняет следующие функции:

· воспринимает всю химическую информацию, поступающую в клетку из внешней среды;

· является основным осмотическим барьером, благодаря которому внутри клетки поддерживается определенное осмотическое давление;

· совместно с клеточной стенкой участвует в регуляции роста и клеточного деления бактерий;

· участвует в регуляции процессов репликации и сегрегации хромосом и плазмид;

· в цитоплазматической мембране содержится значительное количество ферментов, в том числе системы переноса электронов;

· участвует в процессах транспорта питательных веществ в клетку и продуктов жизнедеятельности из клетки в окружающую среду;

· участвует в синтезе компонентов клеточной стенки и образовании мезосом;

· с цитоплазматической мембраной связаны жгутики и аппарат регуляции их движения.

Цитоплазма бактерий представляет собой сложную коллоидную систему. Она неподвижна. В цитоплазме располагаются ядерный аппарат – нуклеоид, плазмиды, рибосомы, мезосомы, различные включения.

Нуклеоид состоит из одной замкнутой спиральной нити ДНК. Длина нити – около 1 мм. Это одиночная бактериальная хромосома. В нуклеоиде также находятся РНК – полимераза, основные белки (но не гистоны). Бактериальная хромосома имеет вид бус. Один конец её часто связан с мезосомой.

Плазмиды – внехромосомные генетические структуры бактерий. Представляют собой замкнутую молекулу двухнитчатой ДНК, связанную с белком. Локализуются в цитоплазме клетки или в состоянии интеграции с хромосомой. Приобретение или утрата плазмид приводит к приобретению или утрате одного или нескольких признаков, хотя существуют «немые» плазмиды. Наиболее известны F – плазмида, R – фактор, Col – плазмида.

Мезосомы – мембранные структуры бактерий, выполняющие функцию генерации энергии, аналоги митохондрий эукариот. Способны ассоциироваться с рибосомами. Представляют собой инвагинации цитоплазматической мембраны, на которой локализованы ферменты дыхания.

Рибосомы – внутриклеточные органоиды, осуществляющие синтез белка. Состоят из белка и трех типов РНК, построены из 2 субъединиц. Бактериальные рибосомы не связаны с мембранным аппаратом, имеют константу седиментации 70S.

Для изучения морфологии бактерий из них готовят нативные (прижизненные) препараты и фиксированные мазки. Фиксированные окрашенные препараты позволяют разграничить бактерии, выявлять детали строения микробной клетки, они удобны в практической работе, особенно при изучении патогенных микроорганизмов. Подготовка фиксированных препаратов включает приготовление мазка, высушивание его, фиксацию и окрашивание мазка.

Для приготовления мазка на чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю физиологического раствора, в которую петлей вносят исследуемый материал с плотной питательной среды и распределяют так, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1 – 1,5 см. При приготовлении мазков из жидких культур исследуемый материал непосредственно наносится на предметное стекло.

Высушивание мазка проводится на воздухе или в струе тёплого воздуха.

Фиксация мазка производится с целью прикрепления микроорганизмов к стеклу и обеззараживания препарата. Кроме того, фиксированные бактерии лучше воспринимают красители. Для фиксации мазков высушенный препарат проводят 3 – 4 раза через пламя горелки, причём в пламени препарат следует выдерживать не более 2 секунд. Если фиксация проведена правильно, стекло при прикосновении к тыльной поверхности руки тотчас после окончания процесса фиксации слегка обжигает кожу. В некоторых случаях мазки можно фиксировать путем погружения в этиловый спирт на 15 – 20 минут, в смесь равных объёмов этилового спирта и эфира (смесь Никифорова) на 15 – 20 минут, в ацетон на 5 минут.

Окрашивание мазков осуществляется растворами анилиновых красителей. В основе окраски лежат сложные химические и физико – химические процессы взаимодействия компонентов микробной клетки с анилиновыми красителями. Красящая способность последних зависит от наличия у них карбоксильных, серосодержащих, аминогрупп, от заряда микробной клетки. Для окраски микроорганизмов используют, главным образом, основные красители­­ - метиленовый синий, кристаллический фиолетовый, генциан фиолетовый, фуксин, гематоксилин, везувин и др.. Для выявления различных структурных элементов бактериальной клетки применяют нейтральные и кислые красители­­ (нейтральный красный, кислый фуксин, Конго, пикриновая кислота и др.). Отношение микроорганизмов к красителям определяет их тинкториальные свойства.

Различают простые и сложные методы окраски. Первые состоят в окрашивании мазков одним красителем и дают возможность ознакомиться с общей морфологией микробов. Сложные, или дифференцированные, способы окраски производятся различными красителями и применяются для детального изучения структуры клетки, а также для характеристики и дифференциации данного микроба от других.

ЗАДАНИЕ

1. Приготовить мазки из жидкой культуры бактерий и с плотной питательной среды.

2. Окрасить мазок простым способом, для чего на фиксированный препарат нанести водный раствор фуксина (фуксин Пфейффера) на 1 – 2 мин или раствор метиленового синего на 3 – 5 мин, затем краску слить, препарат ополоснуть водой и просушить с помощью фильтровальной бумаги. Микроскопировать с иммерсионной системой и зарисовать.

3. Окрасить мазок дифференцированным методом.

Техника окраски по Граму

а) на фиксированный препарат поместить полоску фильтровальной бумаги и на неё нанести раствор­­ карболового генцианвиолета на 1 – 2 минуты;

б) краситель слить, снять фильтровальную бумагу и обработать препарат в течение 1 – 2 минут раствором Люголя до почернения препарата;

в) слить раствор Люголя и на препарат нанести несколько капель этилового спирта на 30 – 60 сек;

г) промыть водой и докрасить препарат водным фуксином в течение 1 – 2 минут;

д) слить краску, промыть водой, высушить и микроскопировать препарат с иммерсионной системой.

При данном методе одни бактерии окрашиваются в тёмно – фиолетовый цвет (грамположительные), другие – в красный или розовый (грамотрицательные). Сущность метода состоит в том, что клеточная стенка грамположительных бактерий прочно фиксируют комплекс генцианвиолет – раствор Люголя, не обесцвечивается этанолом и потому не воспринимает дополнительный краситель (фуксин). У грамотрицательных микробов комплекс легко вымывается из клетки этанолом, и они окрашиваются дополнительным красителем.

Зарисовать грамположительные и грамотрицательные бактерии.

4. Изучить в готовых препаратах различные формы микроорганизмов: шаровидные, палочковидные, извитые, нитевидные.

Контрольные вопросы

1. Каковы морфологические и структурные особенности строения бактериальной клетки?

2. Какова структура, химический состав и функции клеточной стенки бактерий?

3. Какими отличительными особенностями характеризуются клеточные стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий?

4. Какую роль играет цитоплазматическая мембрана?

5. Каковы особенности организации ядерного аппарата бактерий?

6. Чем характеризуются плазмиды?

7. Что собой представляют цитоплазма, мезосомы и рибосомы бактерий?

8. Как и для чего производится фиксация мазков?

9. В чём состоит механизм окраски бактерий и от чего он зависит?

10. С какими целями применяются простые и сложные методы окраски?

11. В чём заключается принцип окраски по Граму?

12. Каковы преимущества исследования бактерий в живом состоянии и в фиксированных окрашенных препаратах?