Генетическая изменчивость бактерий. Мутации их значение. Репарация ДНК.

Мутации - это изменения в последовательности нуклеотидов ДНК, проявляющиеся наследственно закрепленной утратой или изменением какого-либо признака или группы признаков. В их основе лежат ошибки копирования наследственной информации, возникающие при репликации. Фенотипическим проявлением мутации могут быть: изменение морфологии бактериальной клетки, возникновение потребности в факторах роста (например, в аминокислотах, витаминах), т.е. ауксотрофность; появление устойчивости к антибиотикам; изменение чувствительности к температуре; снижение вирулентности (аттенуация). Мутации у бактерий носят ненаправленный характер.

*Мутации могут быть спонтанными, т.е. возникающими самопроизвольно, без воздействия извне, и индуцированными. Спонтанные мутации появляются в результате ошибок репликации ДНК, неправильного формирования комплементарных пар оснований, структурных искажений ДНК и вследствие перемещения подвижных генетических элементов в процессе роста и размножения популяции бактерий. Спонтанные мутации могут обусловливать благоприятные и неблагоприятные генетические изменения. Обратная мутация или реверсия, в результате которой восстановятся свойства дикого штамма. *Индуцированные мутации возникают под влиянием внешних факторов, которые называют мутагенами. Мутагены бывают физическими (УФ-лучи, γ-радиация), химическими (аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований, например, 2-аминопурин, азотистая кислота и ее аналоги, алкилирующие агенты и др.) и биологическими (транспозоны).

*Реверсия повреждений ДНК. К механизмам прямой реверсии повреждений ДНК относится световая репарация или фотореактивация (исправление деформации ДНК под действием УФ-лучей). Световая репарация осуществляется несколькими ферментами: фотолиазой (расщепляет тиминовый димер и восстанавливает целостность соседних тиминовых оснований), О 6 -метилтрансферазой (удаляет О 6 -метильную группу из остатков гуанина после действия метилирующих агентов), ДНК-пурин инсертазой (осуществляет встраивание утерянного при мутации основания в апуриновый сайт), ДНК-гликозилазой (удаление дефектных оснований). Все эти процессы происходят в один этап под действием конкретного фермента и безошибочно восстанавливают исходную структуру ДНК.

Системы эксцизионной репарации удаляют неправильно спаренные или поврежденные основания из ДНК и синтезируют новую последовательность ДНК, замещающую их. Место повреждения распознает эндонуклеаза, расщепляющая цепь ДНК вблизи дефекта, фрагмент удаляется, а дефект восполняется при помощи ДНК-полимеразы, которая проникает в брешь и встраивает в нее отсутствующие нуклеотиды, используя неповрежденную цепь ДНК в качестве матрицы. ДНК-лигаза ковалентно связывает 3' -конец вновь синтезированного участка ДНК с цепочкой. Поскольку эта система репарации основана на ресинтезе нуклеотидной цепи на базе неповрежденной матрицы, она также является практически безошибочной.

Репарационные механизмы устойчивости к повреждениям ДНК. Кроме механизмов исправления повреждений клетки имеют возможность `обойти' вызванную повреждениями блокаду репликации ДНК, например, путем репарации в процессе рекомбинации.

47.Фенотипическая изменчивость бактерий. Значение для практической микробиологии.

Временные, наследственно не закрепленные изменения называются модификациями. Модификации также контролируются геномом бактерий, но (в отличие от мутаций) не сопровождаются изменениями кодирующей структуры и быстро утрачиваются. Чаще всего у бактерий отмечаются морфологические (приводящие к обратимым изменениям формы) и биохимические (проявляются индуцибельным синтезом некоторых продуктов, чаще ферментов) модификации. Модификации возникают как адаптивные реакции бактериальных клеток на изменения окружающей среды, что позволяет им быстро приспосабливаться и сохранять численность популяции на жизнеспособном уровне. После устранения соответствующего воздействия, вызвавшего их образование, бактерии возвращаются к исходному фенотипу.

Стандартное проявление модификации - разделение однородной популяции на несколько типов. Этот феномен получил название диссоциация микробов. Обычно диссоциации возникают в условиях, неблагоприятных для исходной популяции. Примером диссоциации может служить изменение вида и структуры бактериальных колоний на твердых питательных средах. Для обозначения диссоциирующих колоний используют первые буквы английских названий: S -колонии (от англ. smooth - гладкий); R -колонии (от англ. rough - шероховатый); М-колонии (от англ. mucoid - слизистый) и D -колонии (от англ. dwarf - карликовый). Диссоциации сопровождаются изменениями биохимических, морфологических, антигенных и патогенных свойств возбудителей.

Изменение фенотипа следует считать модификацией, если выполняются три основных условия:

определенность (связь изменения фенотипа с определенным фактором);

общность изменений в популяции;

обратимость (восстановление признака после прекращения действия фактора).

48.Применение генетических методов в диагностике инфекционных заболеваний. ПЦР, ДНК и РНК зондирование.

Для диагностики инфекционных заболеваний генетическими методами маркером возбудителя является его геном. Методы индикации нуклеиновых кислот применяют для диагностики вирусных инфекций, для идентификации бактерий (особенно таких, которые трудно выделить) и для определения точного таксономического положения микроорганизмов. Методы позволяют обнаружить микроорганизм в исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию ДНК без его выделения в чистую культуру.

Метод молекулярной гибридизации основан на способности ДНК и РНК специфически соединяться (гибридизироваться) с комплементарными олигонуклеотидными фрагментами, искусственно синтезированными и меченными ферментом, флюорохромом или изотопом. Эти фрагменты называются зондами.

Для проведения молекулярной гибридизации молекулу исследуемой ДНК расплетают, одну нить закрепляют на специальном фильтре, который помещают в раствор, содержащий меченый зонд (рис. 4). Создаются условия, благоприятные образованию двойных спиралей. При наличии комплементарности между зондом и исследуемой ДНК они образуют между собой двойную спираль. После окончания гибридизации и отмывания несвязавшихся продуктов проводится детекция образовавшегося комплекса при помощи соответствующей метки.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на многократном увеличении числа копий (амплификации) определенного участка ДНК, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой (рис. 5). ПЦР - это очень чувствительный метод, теоретически для получения результата достаточно наличие в материале одной молекулы ДНК.

ПЦР состоит из трех основных этапов: подготовки исследуемой пробы (изоляция ДНК или РНК), собственно ПЦР и детекции продукта ПЦР (амплифицированной ДНК). При использовании РНК в качестве матриц для ПЦР предварительно на этой РНК-матрице посредством фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы или ревертазы) синтезируют комплементарную ДНК, которая затем используется в качестве матрицы в ПЦР. После того, как из бактерий Thermous thermophilis удалось получить ДНК-полимеразу, которая наряду с полимеразной обладает еще и обратно-транскриптазной активностью, удалось совместить эти две реакции. Этот вариант ПЦР широко применяется для детекции РНК-содержащих вирусов, определения экспрессии вирусных, бактериальных и клеточных генов по их РНК.

Для проведения ПЦР необходимы пять основных компонентов:

*фермент ДНК-полимераза;

*пара олигонуклеотидных праймеров;

*набор нуклеотидов;

*копируемая ДНК;

*ионы Mg +2, необходимые для функционирования ДНК-полимеразы.