Осаждение белка солями тяжелых металлов — КиберПедия 

История развития пистолетов-пулеметов: Предпосылкой для возникновения пистолетов-пулеметов послужила давняя тенденция тяготения винтовок...

Состав сооружений: решетки и песколовки: Решетки – это первое устройство в схеме очистных сооружений. Они представляют...

Осаждение белка солями тяжелых металлов

2017-11-17 348
Осаждение белка солями тяжелых металлов 0.00 из 5.00 0 оценок
Заказать работу

СЕМЕСТР

Раздел I

ЗАНЯТИЕ 1

ТЕМА: Биологические функции и общие свойства белков, аминокислотный состав и методы качественного анализа белков.

ЦЕЛЬ: Разобрать основные функции и строение белков, строение и свойства аминокислот, являющихся структурными единицами белков, ознакомиться с методами качественного определения белковых молекул.

 

ОСНОВНЫЕ ВОПРОСЫ:

1. Строение и свойства аминокислот, входящих в состав белков.

2. Классификация аминокислот, входящих в состав белков.

3. Общие свойства аминокислот.

4. Пептидная связь. Строение и классификация пептидов.

 

Оснащение занятия:

 

Реактивы: 1. Азотная кислота 5%-ная

2. Азотная кислота концентрированная

3. Нингидрин 0,2%-ный спиртовый раствор

4. Универсальный индикатор

5. Едкий натр 0,4%-ный, 10%-ный, 30%-ный

6. Фенолфталеин 0,5%-ный

7.Биуретовый реактив

8. Фенол 2%-ный

9. Реактив Миллона

10.Ледяная уксусная кислота

11.Серная кислота конц.

12.Уксуснокислый свинец 5%-ный

13.Сернокислая медь 1%-ная

14. a-нафтол спиртовый 0,1%-ный

15.Гипобромит натрия 2%-ный

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №1 Определение Р н водных растворов аминокислот

Принцип метода: Водные растворы моноаминокарбоновых кислот дают реакцию, близкую к нейтральной, образуя внутреннюю соль.

Моноаминодикарбоновые кислоты дают кислые растворы, так как одна карбоксильная группа идет на образование внутренних солей, другая диссоциирует с образованием Н+ ионов.

Диаминомонокарбоновые кислоты в водных растворах дают щелочную реакцию за счет одной свободной аминогруппы.

Ход работы: В три пробирки вносят по три капли растворов аминокислот: в первую - глицин 0,1%-ный, во вторую - аспарагиновую кислоту 0,1%-ную, в третью - лизин 0,1%-ный.

Затем добавляют в каждую пробирку по пять капель универсального индикатора. Найденные по шкале значения Рн заносят в таблицу.

 

Аминокислота Рн
  глицин  
  аспарагиновая кислота  
  лизин  

 

Делается вывод по работе.

 

 

Лабораторная работа № 2. Универсальные цветные реакции для обнаружения аминокислот и белков.

 

1) Биуретовая реакция

Принцип метода: Появление цветного окрашивания при биуретовой реакции вызвано образованием комплексного соединения меди с белком или пептидом.

Ход работы: К 3 каплям раствора 10%-ного яичного белка добавляют 1 каплю раствора сульфата меди и 3 капли едкого натра 10%-ного. Должно появиться фиолетовое окрашивание.

Делают выводы по работе.

 

2) Нингидриновая реакция

Принцип метода: a-аминокислоты, полипептиды и белки в присутствии нингидрина дают сине-фиолетовое окрашивание. В образовании цветного продукта принимает участие азот аммиака, образующегося из аминогруппы.

Ход работы: В две пробирки вносят по две капли нингидрина. В первую вносят 3-5 капель раствора 0,1 %-го глицина, а во вторую - 3-5 капель 0,1 %-го раствора яичного белка. Нагревают пробирки. Должно появиться сине-фиолетовое окрашивание.

Делают выводы по работе.

 

Лабораторная работа № 3. Цветные реакции для обнаружения отдельных аминокислот и аминокислот, входящих в состав белков.

 

1) Реакция Миллона

Принцип метода: Тирозин, содержащий фенольный гидроксил с реактивом Миллона (смесь азотнокислых солей окиси и закиси ртути) дает красное окрашивание.

Ход работы: Берут 3 пробирки. В первую вносят 2-3 капли 0,1%-го раствора тирозина, во вторую - 2-3 капли 10%-го раствора яичного белка, в третью - 2-3 капли фенола. Добавляют во все пробирки по 1 капле реактива Миллона и нагревают. В пробирках с тирозином и фенолом должно появиться кирпично-красное окрашивание, а в пробирке с белком сначала должен выпасть белый осадок, который при нагревании краснеет.

Делают выводы по работе.

 

2) Реакция Сакагучи

Принцип метода: Белки в присутствии гипобромита натрия в щелочной среде дают красное окрашивание с a-нафтолом. Реакция обусловлена наличием в белке аминокислоты аргинина, имеющей в своем составе гуанидиновую группировку, которая, окисляясь гипобромитом натрия, образует с a-нафтолом продукт конденсации красного цвета.

Ход работы: Берут две пробирки. В первую добавляют 5 капель 1%-ного раствора яичного белка, во вторую - 5 капель 1%-ного раствора желатина. В обе пробирки добавляют по 5 капель 10%-ного едкого натра, 3 капли раствора a-нафтола и 1-5 капель раствора гипобромита натрия. Должно появиться красное окрашивание.

Делают выводы по работе.

 

3) Ксантопротеиновая реакция

Принцип метода: Белки, содержащие ароматические аминокислоты, могут легко нитроваться с образованием окрашенных нитропроизводных.

Ход работы: Берут 3 пробирки. В первую вносят 2 капли раствора фенола, во вторую - 2 капли 0,1%-го раствора тирозина или триптофана, в третью - столько же капель 10%-го раствора яичного белка. Во все пробирки добавляют по капле концентрированной азотной кислоты. После нагревания должно появиться желтое окрашивание.

Делают выводы по работе.

 

4) Реакция Адамкевича

Принцип метода: При взаимодействии триптофана с глиоксиловой кислотой (ледяная уксусная кислота содержит примесь глиоксиловой кислоты) образуется соединение фиолетового цвета.

Ход работы: Берут 2 пробирки. В одну добавляют 3 капли 0,1%-го раствора триптофана, в другую - 3 капли 10%-го раствора яичного белка. В обе пробирки добавляют по 3 капли ледяной уксусной кислоты и нагревают, не доводя до кипения. После охлаждения добавляют по стенке 10 капель концентрированной серной кислоты. При стоянии на границе между кислотой и раствором появляется фиолетовое окрашивание.

Делают выводы по работе.

 

5) Реакция Фоля

Принцип метода: Серосодержащие аминокислоты при кипячении со щелочью теряют серу, которая отщепляется в виде сероводорода. Сероводород взаимодействует со щелочью, образуя сульфиды, которые можно обнаружить с помощью ацетата свинца.

Ход работы: Берут две пробирки. В первую вносят 3 капли 0,5%-го раствора цистеина, во вторую - 3 капли 10%-го раствора яичного белка. В обе пробирки добавляют по 3 капли 30%-го едкого натра и осторожно нагревают в течение 2 мин. После охлаждения добавляют каплю ацетата свинца.

Делают выводы по работе.

 

ЗАНЯТИЕ 2

 

ТЕМА: Структурная организация, физико-химические своиства и методы выделения, а также количественного определения белков.

ЦЕЛЬ: Разобрать уровни организации белковых молекул, ознакомиться с физико-химическими свойствами белков, методами выделения и количественного анализа белков.

 

ОСНОВНЫЕ ВОПРОСЫ:

1. Структурная организация белков: первичная, вторичная, третичная, четвертичная структура и связи, стабилизирующие их.

2. Основные физико-химические свойства белков, молекулярная масса, изоэлектрическая точка.

3. Денатурация белков(обратимая и необратимая).

4. Методы выделения и очистки белков.

5. Классификация белков по химическому строению и функциям.

 

Оснащение занятия:

 

Реактивы: 1. Сульфат меди 10%-ный

2. Сульфат цинка 5%-ный

3. Уксуснокислый свинец 5%-ный

4. Серная кислота конц.

5. Соляная кислота конц.

6. Трихлоруксусная кислота 10%-ная

7. Сульфосалициловая кислота 10%-ная

8. Сернокислый аммоний насыщенный

9. Набор реактивов для ДСН-электрофореза в ПААГ

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №1 Осаждение белка под действием различных денатурирующих факторов

Высаливание белков

Принцип метода: В присутствии нейтральных солей(сульфат аммония, сульфат натрия, сульфат магния, хлористый натрий и т. д.) заряд белков нейтрализуется, что понижает их устойчивость в растворе. Данный процесс носит название высаливания и является обратимым.

Ход работы: В пробирку наливают 20 капель неразведенного яичного белка, добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония, содержимое перемешивают, выпадает осадок яичного глобулина.

Осадок отфильтровывают, а к надосадочной жидкости добавляют порошок сульфата аммония. При этом в осадок выпадает яичный альбумин. Делаются выводы по работе.

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2. Количественное определение белка по методу Биурета.

 

Принцип метода: Белки, реагируя в щелочной среде с сернокислой медью, окрашиваются в фиолетовый цвет. Интенсивность окраски зависит от количества белка в пробирке. Определив оптическую плотность раствора (экстинцию) в нескольких пробирках с известным количеством белка, можно построить график зависимости экстинции от количества белка - калибровочную кривую, по которой, зная экстинцию пробирки с неизвестным количеством белка, легко определить его количество.

Ход работы: К 5 мл биуретового реактива добавляют 0,1 мл яичного белка. Через 15 мин. пробу колориметрируют на ФЭКе при зеленом светофильтре. Показатель экстинции учитывают в сравнении с контрольной пробой. Расчет ведут по калибровочной кривой. Делаются выводы по работе.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА№ 3. Определение молекулярной массы белков при помоши электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН)

Принцип метода: Электрофоретическое разделение белков в ПААГ основано на способности белков двигаться в электрическом поле. ПААГ обладает пористой структурой благодаря поперечным сшивкам, создающим молекулярное сито, сквозь которое белки будут двигаться в зависимости от их заряда, формы и размеров.

Метод ДСН-электрофореза в ПААГ позволяет разделять белки по их молекулярной массе, поскольку все белки, связывая ДСН, становятся отрицательно заряженными.

Ход работы: К 10 мл раствора акриламида добавляют 1 мл раствора бисакриламида, 15 мл фосфатного буфера, содержащего 0,1%-ный ДСН,, 2,5 мл воды, 1,5 мл раствора персульфата аммония и 0,04 мл ТЕМЕД, катализирующих полимеризацию акриламида. Полученную смесь осторожно перемешивают и заливают в электрофоретическую кювету. Уровень вносимой жидкости должен находиться на расстоянии 0,5-1 см от верхнего края кюветы. Сверху осторожно вставляют гребень для формирования карманов геля, в которые после полимеризации геля вносят анализируемые образцы. Предварительно образцы белков кипятят 5 мин в присутствии 1%-го ДСН и 1%-го b-меркаптоэтанола, восстанавливающего сульфгидрильные группы белков, добавляют глицерин до 1%-ной концентрации и краситель.

После того как кювета помещена в прибор для электрофореза, заливают в него 0,02 М натрий-фосфатный буфер и вносят в каждый карман геля по 10-50 мкл образца белка. Электрофорез проводят при напряжении 120 - 150 В до тех пор, пока фронт красителя не дойдет до нижнего края геля.

После завершения электрофореза гель вынимают из кассеты и помещают в раствор красителя кумасси бриллиантового синего. Время окрашивания 30-60 мин, после чего гель помещают в 7%-ный раствор уксусной кислоты для отмывки геля. Затем гель помещают на фильтровальную бумагу и высушивают в вакуумной сушилке.

По электрофореграмме определяют электрофоретическую подвижность (Rf) маркерных белков, которая равна отношению расстояния, пройденного каждым белком от линии старта к расстоянию, пройденному красителем.

Находят десятичные логарифмы молекулярных масс маркерных белков и строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс значения Rf, а по оси ординат - логарифмы молекулярных масс. Используя калибровочный график, находят логарифм молекулярной массы исследуемого белка.

 

РАЗДЕЛ II. ФЕРМЕНТЫ

ЗАНЯТИЕ 3

ТЕМА: Строение и общие свойства ферментов.

ЦЕЛЬ: Изучить химическую природу ферментов, их строение и свойства.

 

ОСНОВНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Понятие о ферментах как биологических катализаторах. Химическая природа ферментов.

2. Строение ферментов. Кофакторы. Активный центр ферментов. Изоферменты.

3. Свойства ферментов: термолабильность, зависимость активности от рН среды, специфичность.

 

Оснащение занятия:

 

Реактивы: 1. a-амилаза слюны

2. пепсин

3. трипсин

4. крахмал 0,5%-ный

5. буферные растворы: рН-2, рН-7, рН-9

6. йод 5%-ный спиртовый раствор

7. окрашенный денатурированный яичный белок

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1. Влияние температуры на активность амилазы слюны.

Принцип метода: Для ферментов характерно такое свойство белков как термолабильность. Для большинства ферментов скорость ферментативного катализа при увеличении температуры возрастает, достигая максимума при температуре 38-40° С, выше которой скорость ферментативной реакции начинает падать ввиду тепловой денатурации молекул фермента.

Крахмал в присутствии ионов йода дает синее окрашивание, по интенсивности которого можно судить об активности амилазы, гидролизующей молекулы крахмала.

Ход работы: В 3 пробирки вносят по 0,5 мл слюны и 0,5 мл раствора крахмала. Первую пробирку ставят в стакан со льдом, вторую - в водяную баню с температурой воды 38°С, а третью - в кипящую водяную баню. Все пробирки инкубируют 10 мин, после чего пробирки помещают в штатив и добавляют в каждую по 5 капель раствора йода.

Делают выводы по работе.

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2. Влияние рН среды на активность пепсина и трипсина.

Принцип метода: Активность ферментов зависит от рН среды, в которой они находятся. Пепсин и трипсин гидролизуют пептидные связи белков. рН-оптимум для пепсина равен рН2, в то время как рН-оптимум трипсина - рН 7.

При инкубировании окрашенных кусочков денатурированного яичного белка с ферментом краситель будет переходить в раствор в результате гидролиза молекул яичного белка. Чем выше будет активность фермента, тем интенсивнее будет окрашиваться раствор.

Ход работы: В три пары пробирок наливают по 2 мл буферного раствора с рН2, 7 и 9. В каждую пробирку вносят по кусочку (20-30 мг) окрашенного яичного белка. В первый ряд пробирок добавляют по 20 мг пепсина, а во второй ряд - по 20 мг трипсина и инкубируют 15 мин при 37°С периодически помешивая растворы.

Делают выводы по работе.

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №3. Определение специфичности действия амилазы и трипсина.

Принцип метода: Способность катализировать только определенные химические реакции связано с таким свойством ферментов как специфичность. Субстратом амилазы являются полисахариды (крахмал, гликоген), а субстратом трипсина - белки.

Ход работы: Берут 4 пробирки. В пробирку № 1 и 2 добавляют по 0,5 мл раствора крахмала, а в пробирки № 3 и 4 - по кусочку окрашенного яичного белка и по 0,5 мл воды. Затем в пробирки № 1 и 3 добавляют по 0,5 мл слюны, а в пробирки № 2 и 4 - по 0,5 мл 1%-го раствора трипсина. Все пробирки инкубируют при 37°С в течение 10-15 мин.

Делают выводы по работе.

ЗАНЯТИЕ 4

ТЕМА: Механизм действия ферментов. Кинетика ферментативной реакции.

ЦЕЛЬ: Изучить механизм ферментативного катализа, особенности протекания ферментативной реакции.

 

ОСНОВНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Механизм ферментативнго катализа. Теория “ключа и замка” и “индуцированного соответствия”.

2. Явление насыщения молекул фермента молекулами субстрата.

3. Уравнение Михаэлиса-Ментен. Константа Михаэлиса.

4. Методы определения и единицы измерения активности ферментов.

 

Оснащение занятия:

 

Реактивы: 1. a-амилаза слюны(разведенная 1: 10)

2. крахмал 0,1%-ный

3. йод 5%-ный спиртовый раствор

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1. Определение активности a-амилазы слюны по Вольгемуту.

Принцип метода: Метод основан на установлении предельного разведения раствора a-амилазы, при котором еще происходит в определенных условиях расщепление заданного количества крахмала до декстрина.

Ход работы: В 10 пробирок наливают по 1 мл воды, затем в пробирку №1 добавляют 1 мл разбавленной в 10 раз слюны, перемешивают, отбирают 1 мл и переносят в пробирку №2 и т.д. Во все пробирки добавляют, начиная с десятой, по 2 мл 0,1%-го раствора крахмала и инкубируют 30 мин при37°С. Затем пробирки охлаждают и добавляют по 1 капле раствора иода. Отмечают пробирку с наибольшим разведением слюны, при котором произошло расщепление крахмала до декстрина, дающего с йодом красно-бурое окрашивание. Активность a-амилазы выражают количеством миллилитров крахмала, которое может расщепить 1 мл неразведенной слюны при 37°С в течение 30 мин до декстрина.

В норме активность амилазы (А 37°/30¢) составляет160-640 единиц.

 

ЗАНЯТИЕ 5

ТЕМА: Регуляция активности ферментов. Активаторы и ингибиторы ферментов. Классификация ферментов.

ЦЕЛЬ: Изучить влияние активаторов и ингибиторов на скорость ферментативных реакций, понять принципы классификации ферментов.

 

ОСНОВНЫЕ ВОПРОСЫ

 

1. Факторы, влияющие на активность ферментов.

2. Активаторы ферментов.

3. Ингибиторы ферментов. Типы ингибирования (специфическое, неспецифическое, обратимое, необратимое, конкурентное, неконкурентное).

4. Классификация ферментов.

 

Оснащение занятия:

 

Реактивы: 1. a-амилаза слюны(разведенная 1: 10)

2. крахмал 0,5%-ный

3. йод 5%-ный спиртовый раствор

4. сернокислая медь - 1%-ный раствор

5. хлористый натрий - 1%-ный раствор

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1. Влияние активатора и неспецифического ингибитора на активность a-амилазы.

Принцип метода: Ионы хлора являются активаторами a-амилазы, поэтому гидролиз крахмала должен происходить быстрее в присутствии хлорида натрия. Тяжелые металлы вызывают денатурацию белков, что приводит к утрате их биологической активности.

Ход работы: Берут три пробирки. Во все пробирки наливают по 2 мл крахмала. В первую пробирку добавляют 1 мл воды, во вторую - 1 мл хлорида натрия, в третью - 1 мл сульфата меди, после чего во все пробирки добавляют по 1 мл разбавленной слюны, и инкубируют 5-10 мин при комнатной температуре. Затем во все пробирки добавляют по 1 капле иода.

Делают выводы по работе.

 

 

ЗАНЯТИЕ 6

ТЕМА: Нуклеиновые кислоты. Строение, свойства.. Репликация ДНК.

ЦЕЛЬ: Изучить строение и свойства нуклеиновых кислот, процесс удвоения ДНК в клетках.

ОСНОВНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Строение нуклеиновых кислот, типы нуклеиновых кислот, их биологическая роль.

2. Репликация ДНК. Инициация репликации. Роль в этом процессе ДНК-топоизомераз и ДНК-хеликазы.

3. Типы ДНК-полимераз и их роль в синтезе дочерних цепей ДНК (лидирующая и

отстающая цепь).

4. Теломерная ДНК и ее роль в сохранении генетической информации.

5. Использование ДНК-технологий в медицине. Получение рекомбинантных ДНК

и их амплификация.

 

Оснащение занятия:

 

Реактивы: 1. едкий натр 10%-ный раствор

2. хлористый натрий насыщенный раствор в 20%-ном растворе уксусной

кислоты

3. Трихлоруксусная кислота 5%-ный раствор

4. этиловый спирт

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1. Выделение ДНК из животных тканей.

Принцип метода: При добавлении к щелочному гидролизату ткани насыщенного раствора хлорида натрия в уксусной кислоте белки выпадают в осадок, ДНК и другие фосфорные соединения остаются в растворе, от которых ДНК отделяют путем осаждения ее спиртом.

Ход работы: Навеску ткани(печень, мышцы легкие) 150-200 мг помещают в центрифужную пробирку с 1 мл 10%-го NaOH и ставят на гидролиз в кипящую водяную баню на 3-5 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой. После того как ткань растворится, пробирку охлаждают до комнатной температуры, а затем добавляют 0,5 мл насыщенный раствор хлористого натрия в 20%-ном растворе уксусной кислоты и ставят на лед. При этом белок выпадает в осадок. Через 3-5 мин пробирку центрифугируют при 2500 об/мин в течение 3 мин. Супернатант переливают в центрифужную пробирку с 5 мл охлажденного на льду этанола. Для полного удаления ДНК из белковой фракции осадок вновь растворяют в 1 мл 4%-го раствора NaOH и добавляют 0,5 мл насыщенного раствора хлорида натрия в 20%-ом растворе уксусной кислоты. Пробу вновь центрифугируют и супернатант присоединяют к первому, находящемуся в спирте, а осадок отбрасывают. Содержимое пробирки перемешивают и инкубируют 1 час на ледяной бане. Затем пробирку центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5-7 мин. Супернатант, содержащий РНК и другие фосфорные соединения, отбрасывают. Осадок ДНК промывают 5 мл 5%-го раствора трихлоруксусной кислоты, еще раз центрифугируют при тех же условиях, супернатант отбрасывают.

ЗАНЯТИЕ 7

ТЕМА: Синтез белка. Транскрипция и трансляция.

ЦЕЛЬ: Изучить этапы реализации генетической программы в клетке.

ОСНОВНЫЕ ВОПРОСЫ

 

1. Этапы транскрипции. Роль РНК-полимераз.

2. Посттранскрипционнаая модификация матричной РНК (кэпирование, полиаденилирование, сплайсинг).

3. Генетический код и его свойства: триплетность, специфичность, вырожденность, универсальность.

4. Этапы трансляции. Роль тРНК и рРНК.

5. Полиморфизм белков. Иммуноглобулины.

Оснащение занятия:

 

Реактивы: 1. нитрат серебра 1%-ный раствор

2. Молибденовый реактив

3. Реактив Фелинга

4. едкий натр 10%-ный раствор

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1. Определение компонентов ДНК.

 

Принцип метода: В ходе гидролиза нуклеиновые кислоты распадаются на основные компоненты: пуриновые и пиримидиновые основания, пентозу и фосфорную кислоту. Пуриновые и пиримидиновые основания образуют в присутствии нитрата серебра нерастворимые серебряные соли, образующие аморфный осадок. Наличие пентозы в растворе определяется по способности восстанавливать в щелочной среде ионы металлов. Фосфорная кислота в присутствии молибденовокислого аммония образует осадок фосфорно-молибденовокислого аммония желтого цвета.

Ход работы: Для открытия пуриновых и пиримидиновых оснований к3 каплям щелочного раствора ДНК добавляют 2 капли раствора нитрата серебра. Должен появиться белый аморфный осадок.

Для обнаружения дезоксирибозы к 3 каплям щелочного раствора ДНК добавляют 3 капли реактива Фелинга и нагревают. Появляется желтый осадок.

Для обнаружения фосфорной кислоты к 10 каплям щелочного раствора ДНК добавляют 20 капель молибденового реактива и нагревают. После охлаждения должен появиться желтый кристаллический осадок.

Делаются выводы по работе.

 

ЗАНЯТИЕ 8

ВОПРОСЫ 1-Й РУБЕЖНОЙ АТТЕСТАЦИИ

1. Что такое белки и какие основные функции они выполняют в организме?

2. Аминокислоты, как структурная единица белка.

3. Классификация аминокислот.

4. Алифатические аминокислоты и их характеристика.

5. Участие оксиаминокислот в образовании фосфопротеидов.

6. Гомоциклические аминокислоты.

7. Гетероциклические амино- и иминокислоты.

8. Значение серосодержащих аминокислот в стабилизации третичной структуры

белка.

9. Уровни организации белковых молекул.

10. Физико химические свойства белков.

11. Классификация белков по химическому строению.

12. Методы выделения и очистки белков.

13. Методы разделения белков.

14. Денатурация белков и денатурирующие факторы.

15.Универсальные качественные реакции на белки и качественные реакции на

отдельные аминокислоты в составе белков.

16. Строение ферментов. Активный центр фермента. Аллостерический центр.

17. Роль кофакторов ферментов в ферментативных реакциях.

18. Свойства ферментов (термолабильность, зависимость от рН среды, специфичность)

19. Кинетика ферментативной реакции. Явление насыщения молекул фермента молекулами субстрата

20. Множественные формы ферментов. Изоферменты.

21. Механизм ферментативного катализа

22. Теории ферментативного катализа

23. Уравнение Михаэлиса-Ментен

24. Что такое константа Михаэлиса и чему она численно равна?

25. Основные принципы определения активности ферментов. Единицы измерения активности ферментов

26. Факторы, влияющие на активность ферментов.

27. Активаторы ферментов

28. Ингибиторы ферментов. Типы ингибирования

29. Как меняется кинетика ферментативной реакции в присутствии неконкурентного ингибитора?

30. Как меняется кинетика ферментативной реакции в присутствии конкурентного ингибитора?

31. Классификация ферментов

32. Номенклатура ферментов.

33. Строение пуриновых и пиримидиновых азотистых оснований, входящих в состав ДНК и РНК.

34. Строение рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов.

35. Первичная структура ДНК и РНК.

36. Вторичная, третичная структура ДНК.

37. Виды РНК, вторичная и третичная структура РНК.

38. Биосинтез ДНК (репликация). Основные этапы процесса.

39. Теломерная ДНК и ее роль в сохранении генетической информации.

40. Биосинтез РНК (транскрипция). Основные этапы процесса.

41. Посттранскрипционная модификация РНК (кэпирование, полиаденилирование, сплайсинг).

42. Свойства биологического кода (триплетность, специфичность, универсальость, вырожденность, наличие терминирующих кодонов).

43. Биосинтез белка (трансляция). Основные этапы процесса.

44. Роль тРНК в процессе трансляции.

45. Метод рекомбинантных ДНК и его применение в медицине.

46. Полимеразная цепная реакция.

 

 

ЗАНЯТИЕ 9

ТЕМА: Биологические мембраны.

ЦЕЛЬ: Изучить структурную организацию, функции и свойства биологических мембран.

ОСНОВНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Состав биологических мембран.

2. Строение биологических мембран.

3. Основные свойства биомембран (ассиметрия, полупроницаемость, текучесть, самосборка).

4. Транспорт веществ через мембраны.

5. Трансмембранная передача сигнала.

 

Оснащение занятия:

 

Реактивы: 1. фосфатидилхолин 10%-ный спиртовый раствор

2. холестерин 0,5%-ный спиртовый раствор

3. хлорид калия 5, 50,100мМ растворы

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1. Получение липосом в качестве моделей исследования свойств биологических мембран.

Принцип метода: Полярные липиды в водной фазе структурируются таким образом, чтобы гидрофобные участки молекул были спрятаны от воды. При этом могут образовываться мицеллы или бислой, состоящий из двух рядов молекул липидов, обращенных друг к другу своими гидрофобными участками. При перемешивании сплошной бислой может распадаться и образовывать замкнутые везикулы, внутри которых находится вода, а стенки этих везикул состоят из липидного бислоя. Такие структуры представляют простейшую модель клетки и называются липосомами. В гипотонических растворах вода стремится внутрь липосом и они разбухают, а в гипертонических растворах липосомы сморщиваются за счет выхода воды из липосом. Колебания объема липосом зависят от липидного состава. Их можно наблюдать фотоколориметрическими измерениями.

Ход работы: Отмерить в одну пробирку 0,4 мл фосфатидилхолина, а в другую 0,2 мл фосфатидилхолина и 0,2 мл холестерина. Обе пробирки помещают в водяную баню и выпаривают растворы, затем к осадку липидов добавляют по 1 мл 50 мМ раствора хлорида калия и интенсивно встряхивают до получения молоковидной суспензии липосом. Отбирают из каждой пробирки по 0,2 мл суспензии липосом и добавляют в пробирки с 4,8 мл гипотоничного (5 мМ) и гипертоничного (100 мМ) раствора хлорида калия. Тщательно встряхивают пробирки и через 10 мин измеряют оптическую плотность при 440 нм.

Делают выводы по работе.

 

ЗАНЯТИЕ 10

ТЕМА: Энергетический обмен. Цепь переноса электронов.

ЦЕЛЬ: Изучить как осуществляется обмен веществ и энергии в клетке и какова структурная организация цепи переноса электронов.

ОСНОВНЫЕ ВОПРОСЫ

 

1. Основные этапы обмена веществ. Эндэргонические и экзэргонические реакции.

2. Тканевое дыхание.

3. Роль АТФ в качестве универсального аккумулятора и поставщика энергии в клетке.

4. Структурная организация ЦПЭ.

5. Механизм окислительного фосфорилирования. Хемиосмотическая теория Митчела.

6. Дыхательный контроль.Разобщители тканевого дыхания.

 

Оснащение занятия:

 

Реактивы: 1. Рибофлавин 0,025%-ая суспензия

2. Метиленовый синий 0,01%-ный раствор

3. Соляная кислота концентрированная

4. Цинк гранулированный

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1. Сопоставление редокс-потенциалов рибофлавина и метиленового синего.

Принцип метода: В живых организмах наиболее важными донорами электронов служат атомы водорода органических молекул. При помощи переносчиков электронов осуществляется сложная последовательность реакций тканевого дыхания. Вещество с большим окислительно-восстановительным потенциалом (редокс-потенциалом) окисляет вещество с меньшим окислительно-восстановительным потенциалом.

Для определения окислительно-восстановительных состояний часто используют колориметрический метод, наблюдая изменение окраски специальных редокс-индикаторов. Причем для каждого индикатора зона перехода связана с характерной для него величиной окислительно-восстановительного потенциала. Например, для метиленового синего редокс-потенциал составляет +0,011 В, а для рибофлавина -0,208 В. Из этого следует, что метиленовый синий, обладая более высоким окислительно-восстановительным потенциалом, способен окислить рибофлавин. Обычно в восстановленном состоянии эти индикаторы бесцветны, а в окисленном обладают определенной окраской: метиленовый синий - синей, а рибофлавин - желтой.

Ход работы: В пробирку наливают 5-6 капель воды, 1 каплю суспензии рибофлавина и по каплям добавляют раствор метиленового синего до появления синего или зеленовато-синего окрашивания смеси. Затем в смесь бросают кусочек цинка и капают 1 каплю концентрированной соляной кислоты. Выделяющийся водород восстанавливает метиленовый синий и рибофлавин. Метиленовый синий востанавливается быстрее, поэтому цвет смеси становится сначала зеленым, затем зеленовато-желтым и, наконец, бледно-желтым или розоватым.

Слабо окрашенную жидкость сливают в другую пробирку. При этом в отсутствие водорода восстановленный рибофлавин через метиленовый синий передает электроны и ионы водорода на кислород воздуха и раствор желтеет. После этого происходит окисление восстановленного метиленового синего и раствор становится сначала зеленым, а потом синим.

Делают выводы по работе.

 

 

ЗАНЯТИЕ 11

ТЕМА: Энергетический обмен. Общий путь катаболизма - цикл трикарбоновых кислот.

ЦЕЛЬ: Изучить реакции цикла трикарбоновых кислот, в ходе которых происходит восстановление НАД и ФАД, обеспечивающих транспорт электронов по дыхательной цепи, а также образование конечных продуктов распада.

ОСНОВНЫЕ ВОПРОСЫ

 

1. Цикл трикарбоновых кислот(цикл Кребса) - общий путь катаболизма белков жиров и углеводов.

2. Химические реакции цикла Кребса и их характеристика.

3. Коферменты и ферменты, участвующие в катализировании реакций цикла Кребса.

4. Энергетический эффект цикла Кребса.

 

Оснащение занятия:

 

Реактивы: 1. Мышечная кашица

2. Метиленовый синий 0,01%-ный раствор

3. Цитрат натрия 3%-ный раствор (нейтрализованный по лакмусу)

4. Сукцинат натрия 3%-ный раствор (нейтрализованный по лакмусу)

5. Сульфосалициловая кислота 20%-ный раствор

6. Вазелиновое масло или керосин

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1. Обнаружение дегидрогеназ цикла трикарбоновых кислот.

Принцип метода: Дегидрогеназы цикла трикарбоновых кислот, например, изолимонной(изоцитрат) и янтарной(сукцинат) кислот можно обнаружить в тканях, беря в качестве субстрата соответствующие кислоты, а в роли акцептора водорода - метиленовый синий, по обесцвечиванию которого можно судить об активности этих ферментов. Коферментом изоцитратдегидрогеназы является НАД, а коферментом сукцинатдегидрогеназы - ФАД. Восстанавливаясь эти коферменты будут отдавать водород на метиленовый синий, восстанавливая его до бесцветного лейкосоединения.

Ход работы: В 3 пробирки вносят равные количества мышечной кашицы. В первую пробирку добавляют 10 капель цитрата натрия, во вторую - 10 капель сукцината натрия, в третью - 10 капель сульфосалициловой кислоты. Если в мышечной кашице имеются пузырьки воздуха, их удаляют стеклянной палочкой.

В каждую пробирку добавляют по капле раствора метиленового синего и по 10 капель вазелинового масла или керосина для предотвращения окисления восстановленного метиленового синего кислородом воздуха. Пробирки инкубируют при 37°С. Отмечают постепенное обесцвечивание метиленового синего в пробирках с сукцинатом и цитратом. В пробирке с сульфосалициловой кислотой обесцвечивания метиленового синего не происходит в результате инактивирования ферментов кислотой.

ЗАНЯТИЕ 12

ТЕМА: Строение и свойства углеводов.

ЦЕЛЬ: Изучить структурную организацию моносахаридов, олигосахаридов и полисахаридов.

ОСНОВНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Общая характеристика и классификация углеводов.

2. Строение и свойства моносахаридов. Альдозы и кетозы.

3. Строение и свойства олигосахаридов. Важнейшие дисахариды.

4. Строение и свойства полисахаридов. Гомополисахариды и гетерополисахариды.

 

Оснащение занятия:

 

Реактивы: 1. 1%-ный раствор глюкозы

2. 1%-ный раствор фруктозы

3. 1%-ный раствор мальтозы

4. 1%-ный раствор лактозы

5. 1%-ный раствор сахарозы

6. 1%-ный раствор сернокислой меди

7. 10%-ный раствор едкого натра

8. 10%-ный раствор серной кислоты

9. 0,1%-ный раствор крахмала

10. 0,1%-ный раствор гликогена

11. 1%-ный раствор Люголя

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1. Реакция Троммера

Принцип метода: В щелочной среде альдегидная группа моносахаридов при нагревании окисляется, восстанавливая ионы меди. При этом гидрат окиси меди голубого цвета восстанавливается в гидрат закиси меди желтого цвета или в закись меди кирпично-красного цвета. Сахара, не имеющие свободную альдегидную группу реакции Троммера не дают.

Ход работы: Берут2 пробирки. В первую пробирку добавляют 2 капли раствора глюкозы, а во вторую - фруктозы. Затем в каждую пробирку добавляют по 2 капли 10%-го раствора едкого натра, после чего добавляют по капле 1%-го раствора сульфата меди и нагревают. Сначала появляется желтое, затем оранжевое и, наконец, кирпично-красное окрашивание.

Делают выводы по работе.

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2 Восстанавливающие свойства дисахаидов

Принцип метода: Дисахариды, имеющие свободный глюкозидный (полуацетальный) гидроксил, такие как мальтоза и лактоза, способны восстанавливать металлы. Сахароза, у которой отсутствует свободный полуацетальный гидроксил, не обладает способностью к восстанавлению металлов.

Ход работы: Берут 3 пробирки. В первую добавляют 3 капли раствора мальтозы, во вторую - столько же лактозы и в третью - сахарозы. Затем с каждым дисахаридом проделывают реакцию Троммера. Для этого добавляют в каждую пробирку по 2 капли раствора едкого натра и по 1 капле раствора сульфата меди. После нагревания в первой и второй пробирках происходит восстановление меди с появлением желтого и красного окрашивания, в третьей пробирке с сахарозой окрас


Поделиться с друзьями:

Папиллярные узоры пальцев рук - маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни...

Таксономические единицы (категории) растений: Каждая система классификации состоит из определённых соподчиненных друг другу...

Индивидуальные очистные сооружения: К классу индивидуальных очистных сооружений относят сооружения, пропускная способность которых...

История развития пистолетов-пулеметов: Предпосылкой для возникновения пистолетов-пулеметов послужила давняя тенденция тяготения винтовок...



© cyberpedia.su 2017-2024 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав. Мы поможем в написании вашей работы!

0.267 с.