Методы количественной гистологии (морфометрия)

В современной гистологии значительный дополнительный объем ин­формации о гистологическом объекте можно получить при помощи коли­чественных методов. Наиболее простым количественным гистологическим исследованием является подсчет гистологических структур в поле зрения микроскопа или на единицу площади среза. К морфометрическим методам относится также определение размеров гистологических объектов с помо­щью окуляр-микрометра — специальной микролинейки, вставленной в окуляр микроскопа. С морфометрической целью используются и морфо-метрические сетки. На этих сетках имеются точки (узлы). Так, например, наиболее часто используемая морфометрическая сетка Г.Г. Антандилова представляет собой прямоугольник, разделенный на два квадрата. Один из квадратов разделен на 4 более мелких квадрата. В каждом из этих малых квадратов имеется по 25 точек (всего 100 точек). Неразделенный большой квадрат содержит 25 точек. При помощи морфометрической сетки можно определить объемные доли различных структур в гистологическом объекте. Для этого случайным образом накладывают сетку определенное число раз на срез ткани или органа в гистопрепарате и подсчитывают количество точек, выпадающих на различные структуры. Предположим, в препарате соедини­тельной ткани 10 точек выпало на клетки, а на межклеточное вещество при­шлось 90 точек. Следовательно, объемная доля межклеточного вещества 90%, а клеток — 10%. Все эти виды морфометрии называются ручной морфометрией.

В настоящее время существуют достаточно сложные приборы, которые позволяют автоматически производит!) количественные гистологические и гистохимические исследования. Это так называемые автоматизированные системы анализа изображений (АСАИз). В их состав входят: сканирующий световой или электронный микроскоп; видеокамера, которая осуществляет просмотр объекта по двум координатам, а затем следует преобразование его в цифровую форму; ЭВМ, которая обрабатывает полученную цифро­вую информацию и представляет данные о характеристиках исследуемого объекта. С помощью светового дисплея исследователь имеет возможность выделить только интересующие его структуры и получить о них цифро­вую информацию в виде гистограмм и т.д.

ЦИТОСПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ

Это метод изучения химического состава клетки. Он основан на изби­рательном поглощении теми или иными веществами лучей с определен­ной длиной волны. По интенсивности поглощения (она зависит от кон­центрации вещества в клетке) определяют содержание этого вещества.

ЦИТОСПЕКТРОФЛУОРИМЕТРИЯ - это метод количественного изучения веществ в клетке по спектрам их флуоресценции.

ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА

Гистологическая техника — это техника приготовления гистологического препарата. Гистологическим препаратом может быть срез органа, ткани, мазок, отпечаток, пленочный препарат, культура тканей. Во всех случаях гистологический препарат должен отвечать таким требованиям:

1. Быть прозрачным, т.е. пропускать поток света. Для этого изготав­ливают достаточно тонкие срезы органов, тканей, клеток.

2. Быть контрастным, что достигается окрашиванием препарата.

3. Быть постоянным, т.е. сохраняться длительное время и служить в ка­честве своеобразного документа.

Все эти требования к гистологическому препарату и выполняются в ходе гистологической техники.

Гистологическая техника включает в себя несколько этапов: 1. Взятие материала:

— во время операции;

— от трупов;

— от экспериментальных животных;

— путем пункционной биопсии;

— взятие крови, красного костного мозга путем пункции;

— приготовление отпечатков (с полости рта, влагалища и др.). 2. Фиксация материала.

Фиксация полученного гистологического материала — это воздействие на него химическими веществами, а также физическими факторами, что препятствует дальнейшему разрушению тканей объекта, сохраняет его структуру. Физические фиксирующие факторы — замораживание (твердой углекислотой, в жидком азоте, кислороде и т.д.), воздействие высокой тем­пературы, рентгеновское облучение. Все эти факторы вызывают гибель бактерий и инактивируют собственные ферменты тканей, способствуя со­хранению гистологического материала. Химические фиксаторы также вы­зывают гибель микробов и собственных ферментов тканей, стабилизируют структуру объекта. Различают простые и сложные химические фиксаторы. Простые фиксаторы состоят из одного химического вещества (например, формалин, спирт, уксусная кислота и др.). Эти фиксаторы, однако, приво­дят к определенным нарушениям структуры гистологического материала. Так, формалин вызывает сморщивание его, уменьшение в размерах. Уксус­ная кислота, наоборот, вызывает набухание. Поэтому чаще применяют сложные фиксаторы, в которых отрицательное действие простых фиксато­ров нивелируется. Например, фиксатор ФСУ состоит из 4 частей форма­лина, 1 части спирта и 0,3 частей уксусной кислоты. Этот фиксатор вызы­вает весьма незначительные изменения структуры объекта. Известно мно­жество и других сложных фиксаторов.

Промывка.

Для вымывания фиксатора из тканей используют воду или другие ве­щества (спирт).

Обезвоживание.

Из объекта удаляют воду путем помещения его в спирты возрастаю­щей концентрации, а затем в хлороформ.

Уплотнение материала.

Проводится для того, чтобы из объекта можно было приготовить тон­кие срезы. Выполняется путем заливки в парафин, целлоидин или целлоидинпарафин. Можно уплотнить материал и путем замораживания в жид­ком азоте, что используется в гистохимии ферментов. При этом сохраняют­ся интактными все ферменты.

6. Изготовление срезов.

Этот этап выполняется при помощи приборов МИКРОТОМОВ (рис. 2.8). В них используются очень острые ножи, которые закрепляются не­подвижно. Объект, залитый в парафин, движется вперед в течение каждо­го цикла (оборота) на определенное расстояние (3—10 мкм), и с его повер­хности срезаются срезы такой же толщины (ротационный микротом). В микротомах других конструкций (санные микротомы) неподвижно закреп­ляется объект, а нож движется свободно вперед-назад в горизонтальной плоскости и после каждого цикла движений опускается на заданную тол­щину, производя срезы.