Бесклеточная система трансляции

Минимальная	Полная
70S рибосомы E. coli	70S рибосомы E. Coli
иРНК	ИРНК
набор из 20 аминоацил-тРНК	набор из 20 аминокислот
фактор элонгации EF-Tu	набор 20 аминоацил-тРНК-синтетаз
фактор элонгации EF-Ts	набор из 20 тРНК
фактор элонгации EF-G	факторы инициации IF-1, IF-2, IF-3
ГТФ	фактор элонгации EF-Tu
Mg2+ (3-20 мМ)	фактор элонгации EF-Ts
	фактор элонгации EF-G
	фактор s терминации RF-1,RF-2,RF-3
	источники энергии: АТФ, ГТФ
	Mg2+ (3-20 мМ)

Минимальная система трансляции состоит из 8 компонентов. Ее основой являются рибосомы, выделенные из кишечной палочки, в качестве матрицы можно использовать синтетические или выделенные из прокариотических клеток иРНК. Материалом для синтеза полипептида служат присоединенные к транспортным РНК (тРНК) аминокислотные остатки – молекулы аминоацил-тРНК, а источником энергии – молекулы ГТФ. Кроме того, необходимы особые белки – факторы элонгации, которые участвуют в регуляции синтеза полипептида, а также ионы магния, предотвращающие диссоциацию рибосом на субъединицы.

Полная система трансляции содержит 17 компонентов. Она работает более эффективно и способна транслировать любые матрицы, в том числе эукариотические иРНК. В ней аминокислоты не активированы, но для их активации имеются 20 видов тРНК и набор особых ферментов – аминоацил-тРНК-синтетаз, которые присоединяют аминокислоты к тРНК с затратой энергии АТФ. Дополнительно к факторам элонгации добавлены факторы инициации и терминации, которые представляют собой регуляторные белки, обеспечивающие сборку и разборку белоксинтезирующей системы. Большое значение для функционирования белоксинтезирующей системы имеет также концентрация одновалентных ионов и температура.

Вместо прокариотических можно использовать эукариотические рибосомы, например, из проростков пшеницы. Однако для ее эффективной работы необходимо заменить все прокариотические регуляторные белки на соответствующие эукариотические. При этом вместо 3 факторов элонгации используются 2 эукариотических фактора – EF-1 и EF-2, вместо трех факторов инициации используются 10 эукариотических факторов - eIF-1, eIF-2, eIF-3, eIF4A, eIF4B, eIF4C, eIF4D, eIF4E, eIF4F и eIF-5, а вместо 3 факторов терминации – эукариотический фактор терминации eRF.

Уже из краткого описания белоксинтезирующих систем видно, что эукариотическая система содержит больше регуляторных белков, причем точкой приложения большинства из них являются начальные этапы трансляции, связанные со сборкой системы.

Биосинтез белка

Биосинтез белка состоит из трех этапов – инициации, элонгации и терминации.

На этапе инициации происходит сборка белоксинтезирующей системы. Она начинается с присоединения малой субъединицы рибосомы к 5’-концу иРНК. РНК-матрицы содержат копии структукрных генов - рамки считывания на некотором удалении от 5’-конца. Поэтому после присоединения к иРНК малая субъединица рибосомы сканирует нуклеотидную последовательность, передвигаясь от 5’- к 3’-концу, пока не найдет начало рамки считывания - стартовый кодон. В качестве стартового кодона прокариотическая рибосома использует кодон AUG и, реже, кодоны GUG и UUG. Эукариотическая рибосома в качестве стартового кодона использует только AUG.

В таблице генетического кода кодону AUG соответствует аминокислота метионин. Однако стартовый кодон в прокариотической белоксинтезирующей системе узнается специальной инициаторной тРНК, которая связана с модифицированной формой метионина – формилметионином. Поэтому любой полипептид, синтезированный in vitro с помощью бактериальных рибосом начинается с аминокислоты формилметионина. Эукариотическая белоксинтезирующая система также начинает полипептид с метионина, но это отнюдь не означает, что клеточные белки на N-конце всегда имеют метионин. После завершения трансляции они, как правило, подвергаются действию ферментов, которые удаляют или модифицируют их N-конец.

После опознания стартового кодона и связывания инициирующей тРНК субъединицы объединяются в полную рибосому. Процесс формирования рибосомы идет с затратой энергии ГТФ. При этом в рибосоме происходит восстановление двух центров связывания – аминоацильного и пептидильного. Аминоацильный центр способен распознавать и связывать аминоацил-тРНК (аминокислотные остатки в комплексе с тРНК), тогда как пептидильный центр удерживает пептидил-тРНК (синтезируемый полипептид в комплексе с тРНК). В синтезе полипептида принимает участие также и третий п ептидилтрансферазный центр, расположенный на большой субъединице рибосомы, который катализирует образование пептидной связи.

Этап элонгации представляет собой собственно процесс синтеза полипептида в соответствии с таблицей генетического кода. Он состоит из повторяющихся стадий связывания, транспептидации и транслокации.

Перед началом следующего рабочего цикла аминоацильный центр (A-центр), расположенный в бороздке между субъединицами, содержит текущий кодон иРНК. На этой же поверхности в бороздке, но на некотором удалении от A-центра располагается пептидильный центр (Р-центр), который удерживает пептидил-тРНК. Между A-центром и Р-центром на большой субъединице располагается пептидилтрансферазный центр. Свободный N-конец полипептида обычно свисает в пространство, выходя по мере его удлинения за пределы рибосомы.

Стадия связывания состоит в распознавании и удержании рибосомой “клеверного листа” аминоацил-тРНК. При этом происходит конкуренция между разными аминоацил-тРНК, но в A-центре задерживается только та молекула, антикодон которой (триплет на вершине среднего лепестка клеверного листа) комплементарен находящемуся в A-центре кодону иРНК. В связывании аминоацил-тРНК с A-центром участвует фактор элонгации EF-Tu и затрачивается энергия ГТФ.

На стадии транспептидации аминоацил-тРНК в A-центре взаимодействует с пептидил-тРНК в P-центре таким образом, что происходит перенос C-конца полипептида из Р-центра в A-центр. При этом С-конец полипептида присоединяется к аминоацил-тРНК с образованием пептидной связи в ходе реакции, которая катализируется пептидилтрансферазным центром.

Во время стадии транслокации рибосома с участием EF-G и ГТФ, обеспечивает перенос пептидил-тРНК из A-центра обратно в Р-центр, из которого перед этим уходит свободная тРНК. Одновременно с возвратом полипептида в Р-центр происходит перемещение иРНК в направлении от 5’- к 3’-концу на один кодон.

Этап терминации наступает в тот момент, когда рибосома встретит в иРНК один из трех терминирующих кодонов – UAA, UGA или UAG. Эти кодоны не кодируют аминокислот и служат сигналами для окончания процесса биосинтеза белка. Терминирующий кодон ограничивает рамку считывания иРНК. Иногда рамка считывания ограничивается даже двумя и более терминирующими кодонами. Когда терминирующий кодон оказывается в A-центре рибосомы, он распознается факторами терминации RF-1 и RF-2 (или eRF эукариот). Связывание факторов терминации A-центром вызывает разрыв связи между тРНК и полипептидом в P-центре и выход белка из рибосомы. После этого из A-центра уходит фактор терминации, из Р-центра – свободная тРНК, а рибосома диссоциирует на субъединицы. Процесс разборки белоксинтезирующей системы идет с затратой ГТФ, с ним взаимодействует RF-3.

При диссоциации рибосомы малая субъединица может сканировать иРНК далее и возобновить трансляцию на следующей рамке считывания в случае полицистронных прокариотических матриц.

 

ЦИТОСКЕЛЕТ

Цитоскелет – это система внутриклеточных компонентов, которые формируют структурную основу клетки. С биохимической точки зрения цитоскелет – это те белковые структуры, которые остаются в клетке после обработки ее неионными детергентами типа твина или нонидета. С цитологической точки зрения цитоскелет представляет собой разнообразный фибриллярный материал, который выявляется в гиалоплазме в световом и электронном микроскопе. Функции цитоскелета достаточно разнообразны и заключаются в поддержании размеров и формы клеток и внутриклеточных структур, перемещении органоидов, сокращении и активном движении клеток.

Прямое доказательство существования цитоскелета у эукариотических клеток были получено в середине 70 гг. XX в. с помощью иммуноцитохимического выявления актина – одного из белков, обеспечивающих движение клеток. Однако некоторые органоиды, представляющие собой специализированные производные цитоскелета, были известны цитологам и ранее. Например, клеточный центр был впервые обнаружен Е. Бенеденом и Т. Бовери в митотически делящихся клетках еще в конце 70 гг. XIX в. В 1891 г. В. Флемминг и М. Гейденгайн показали, что клеточный центр имеется также и у неделящихся клеток, являясь универсальным клеточным органоидом.

Все компоненты цитоскелета состоят из специфических белков, которые способны формировать высокодинамичные супрамолекулярные структуры. Хотя в живой клетке цитоскелет представляет собой единую систему, его компоненты можно разделить на микрофиламенты, микротрубочки, промежуточные филаменты и микротрабекулярную сеть.

Микрофиламенты

Микрофиламенты (актиновые нити) обнаружены как у животных, так и у растений. Главный белок микрофиламентов – актин может находиться в двух формах: глобулярной (G-актин) и фибриллярной (F-актин). Глобулярный актин (молекулярная масса 42 кД) имеет участки связывания двухвалентных катионов и нуклеотидов. В физиологических условиях они заняты магнием и АТФ. Мономеры актина могут соединяться друг с другом, образуя димеры и тримеры, но только тримеры достаточно устойчивы, чтобы быть затравками для дальнейшей полимеризации в F-актин. В полимеризации участвуют оба конца, но скорость их роста различна. Более быстро растущий конец актиновой нити обозначается знаком “+”, а медленно растущий знаком “-”. Полимеризация сопровождается гидролизом АТФ, но происходит также и в присутствии негидролизуемых аналогов АТФ.

В результате полимеризации образуется микрофибрилла толщиной около 6 нм, которая состоит из двух скрученных между собой спиральных лент мономеров. Такая структура находится в динамическом равновесии со свободными мономерами актина, что определяет высокие темпы ассоциации и диссоциации микрофиламентов и их чувствительность к температуре, концентрации двухвалентных ионов и АТФ. В полимеризации актина и стабилизации структуры микрофиламентов участвуют также специальные, связывающие актин белки.

Обратимую деполимеризацию микрофиламентов можно вызвать цитохалазинами B и D из плесневых грибов, которые подавляют элонгацию актина на быстрорастущем конце наподобие гельзолина, фрагмина или виллина. Актин-связывающие белки, регулируя процессы полимеризации и деполимеризации актиновых нитей, регулируют перестройки микрофиламентов при изменении размеров и формы клеток. Например, в эритроцитах имеется тонкая сеть из актина, спектрина и анкирина, связанная с интегральными белками плазмолеммы. Когда эритроцит проходит через капилляр с малым диаметром, актиновые микрофиламенты вызывают удлинение клетки.

Другой пример функции актина относится к эпителиальным клеткам. Многие из них, в том числе и всасывающие клетки кишечника, имеют на своей апикальной поверхности многочисленные микроворсинки, которые увеличивают площадь обмена между клеткой и средой. Микроворсинка представляет собой вырост плазмолеммы эпителиальной клетки высотой 1 мкм и диаметром около 100 нм. Внутри микроворсинки имеется пучок из 30 актиновых микрофиламентов толщиной по 7 нм. На вершине микроворсинки микрофиламенты прикреплены к плазмолемме с помощью a-актинина, а противоположный конец пучка микрофиламентов вплетен в сеть из спектрина. Между актиновыми микрофиламентами располагаются поперечные сшивки из фимбрина и фасцина. Микроворсинки содержат механохимический белок минимиозин, молекулы которого связывают микрофиламенты с плазмолеммой или с поперечными сшивками. При взаимодействии актина с минимиозином микроворсинки могут изменять свою высоту, что обеспечивает регуляцию площади поверхности обмена клетки со средой.

С вязывающие актин белки и их функции

Название	Функция
профилин	в присутствии Ca2+ подавляет образование тримеров
фрагмин	в присутствии Ca2+ подавляет элонгацию
фрагмин виллин	подавляют рост и стыковку нитей, что приводит к формированию коротких фрагментов F-актина
акументин бревин	связываются с “-” концом, что снижает скорость роста нитей
тропомиозин	стабилизирует F-актин
северин	в присутствии Ca2+ фрагментирует F-актин
a-актинин фимбрин фасцин филамин винкулин спектрин анкирин гелактины	сшивают микрофиламенты между собой, а также прикрепляют их к мембранам, промежуточным филаментам и другим структурам
гельзолин	вызывает фрагментацию и диссоциацию филаментов
миозин	механохимический белок, который совместно с актином обеспечивает сокращение и движение клеток

Микрофиламенты способны не только изменять форму клетки или отдельных ее частей. Актино-миозиновые комплексы фибробластов в соединительной ткани отвечают за активное передвижение клеток. Когда фибробласт ползет по поверхности, на его переднем по ходу движения конце периодически возникают и исчезают тонкие пластинчатые выросты – ламеллоподии. Одновременно с формированием ламеллоподий в клетке происходит перестройка актиновых филаментов, которые концентрируются в эктоплазме (слое гиалоплазмы под плазмолеммой) и пучках, соединяющих передний край с центральной частью клетки. Внутриклеточные пучки актиновых нитей (фибриллы натяжения, или фибриллы стресса) участвуют в закреплении фибробласта на коллагеновых волокнах межклеточного вещества соединительной ткани.

Актин и другие белки микрофиламентов обладают тканевой и видовой специфичностью. Однако все формы актина млекопитающих отличаются между собой только концевыми участками, которые влияют главным образом на параметры сборки микрофиламентов. Актин обнаружен также в клетках растений, где он формирует пучки, связанные с плазмолеммой. Эти пучки участвуют в токе цитоплазмы растительной клетки.

Наибольшей сложности актино-миозиновые комплексы достигают в миофибриллах – специализированных органоидах, обеспечивающих сокращение мышечных волокон в скелетной мускулатуре. Они обладают поперечной исчерченностью, что является признаком высокой степени регулярности их супрамолекулярной организации.

Микротрубочки

Микротрубочки представляют собой полые неветвящиеся фибриллы диаметром 25 нм и длиной до нескольких микрометров. В интерфазной клетке одиночные и собранные в рыхлые пучки микротрубочки располагаются по всему объему цитоплазмы. Микротрубочки образуют регулярные структуры в составе клеточного центра, ресничек и жгутиков. В делящихся митозом или мейозом клетках микротрубочки формируют веретено деления.

Подобно микрофиламентам микротрубочки являются линейными полимерами. Они построены из молекул белка тубулина, которые содержат две субъединицы - a и b. Обе субъединицы тубулина имеют одинаковую молекулярную массу 55 кД.

Полимеризация микротрубочек сопровождается гидролизом ГТФ и происходит путем наращивания молекул тубулина на обоих концах затравки. Аналогично микрофиламентам концы микротрубочек полимеризуются с разной скоростью. Полимеризация микротрубочек может происходить в присутствии негидролизуемых аналогов ГТФ, но подавляется кальцием и холодом.

Как и у микрофиламентов, в полимеризации микротрубочек принимают участие вспомогательные белки, которые регулируют различные этапы этого процесса.

Белки, ассоциированные с микротрубочками (БАМ), способны стимулировать полимеризацию тубулина, связываясь с затравками. Образованные БАМ-1 и БАМ-2 боковые выросты микротрубочек часто контактируют с секреторными гранулами, которые могут перемещаться по цитоплазме.