Кинетика ферментативных реакций

- Влияние количества субстрата на скорость химической реакции.

Вначале при увеличении концентрации субстрата скорость реакции быстро возрастает, далее прирост скорости замедляется, а затем прекращается (кривая Михаэлиса).

Km - характеризует сродство фермента к субстрату. Чем Km меньше, тем выше сродство фермента к субстрату (на примере глюкокиназы и гексокиназы).

- Влияние количества фермента на скорость химической реакции.

Зависимость прямо пропорциональная, то есть чем больше фермента в клетке, тем больше скорость ферментативной реакции.

- Влияние температуры на скорость химической реакции.

При увеличении температуры до 40ºС скорость ферментативной реакции возрастает (на каждые 10ºС, в 1,5-2 раза). При дальнейшем повышении температуры скорость реакции резко падает, вследствие тепловой денатурации ферментов.

- Влияние pH среды на скорость химической реакции.

Каждый фермент проявляет максимальную активность при оптимальном для него значении pH среды. Оптимум pH для большинства ферментов лежит в нейтральной среде (исключения: для пепсина оптимум pH - 1,5-2, для щелочной фосфатазы - 9-10).

Активирование ферментов может протекать различными путями, например, активность аллостерических ферментов повышается в присутствии положительного модификатора; проферменты активируются путем гидролиза (пепсиноген ® пепсин); некоторые ферменты активируются по принципу ковалентной модификации (фосфорилирование/дефосфорилирование).

Ингибирование ферментов бывает:

1) необратимое – при связывании с ингибитором активность фермента не восстанавливается (например, действие диизопропилфторфосфата на ацетилхолинэстеразу).

2) обратимое – после отделения ингибитора от фермента его активность восстанавливается.

Конкурентное ингибирование – разновидность обратимого. Конкурентный ингибитор похож по структуре на субстрат и способен связываться с активным центром фермента. Степень ингибирования зависит от соотношения концентраций субстрата и ингибитора. При повышении концентрации субстрата можно снять ингибирование. Примеры конкурентных ингибиторов: малонат Na для сукцинатдегидрогеназы; трасилол для трипсина; прозерин для ацетилхолинэстеразы.

Ингибирование по типу обратной связи: продукты реакции ингибируют аллостерический фермент, который находится в начале биохимического процесса, например, холестерин ингибирует ГМГ-редуктазу.

Специфичность действия ферментов определяется уникальным набором радикалов в активном центре и их расположением. Высокоспецифичные ферменты катализируют превращение только одного субстрата, например, аргиназа действует только на аргинин. Более широкий вид специфичности, когда фермент может действовать на несколько различных веществ, например, монооксигеназа в присутствии цитохрома Р450 окисляет множество различных гидрофобных веществ, ксенобиотиков.

Ферменты классифицируют по типу химической реакции на 6 классов.

I – оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции.

II – трансферазы – обеспечивают перенос групп атомов.

III – гидролазы – расщепляют внутримолекулярные связи с участием воды.

IV – лиазы – катализируют разрыв С-О; С-С; С-N и др. связей без участия воды.

V – изомеразы – катализируют реакции изомеризации, например превращение альдозы в кетозу.

VI – лигазы (синтетазы) – катализируют реакции синтеза молекул с участием АТФ.

Номенклатура ферментов – название ферментов.

Рабочее наименование фермента составляется из названия субстрата + тип реакции + окончание «аза», например, лактатдегидрогеназа.

Систематическое название фермента складывается из названия субстратов + тип реакций + окончание «аза», например, L-лактат:НАД-оксидоредуктаза = ЛДГ₅.

Методы определения активности ферментов:

Активность фермента определяется в стандартных (оптимальных) условиях по:

- убыли концентрации исходных субстратов или

- приросту продуктов реакции.

Единицы активности ферментов:

1Е = 1 мкмоль/мин, то есть это такое количество фермента, которое превращает 1 мкмоль субстрата за 1 минуту при оптимальных условиях.

1 катал = 1 моль/сек.

Удельная активность фермента = мкмоль/(мин ´ мг белка).

Медицинская энзимология

Энзимопатология – раздел медицины, изучающий заболевания, связанные с нарушением функционирования ферментов. Различают энзимопатии:

1) первичные (наследственные), например, фенилкетонурия, галактоземия, гликогенозы и др.

2) вторичные (приобретенные), например, снижение активности пепсина при нарушении выработки соляной кислоты в желудке и др.

Энзимодиагностика – определение активности органоспецифичных ферментов в биологических жидкостях (крови, моче и др.) с целью постановки диагноза заболевания, а также использование ферментных препаратов в качестве реактивов при проведении биохимических анализов. Например, при инфаркте миокарда в сыворотке крови увеличивается активность ЛДГ₁, АСТ (аспартатаминотрансфераза), КФК (креатинфосфокиназа, МВ-форма). При поражении поджелудочной железы – амилаза. При заболевании печении – АЛТ (аланинаминотрансфераза).

Энзимотерапия – использование в лечебных целях ферментов и лекарственных средств, влияющих на активность ферментов. Например, пепсин, трипсин применяют для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта; коллагеназу, гиалуронидазу - для обработки ран с интенсивным воспалением с целью предотвращения келоидных рубцов.

 

2 модуль. Биологическое окисление. Биохимия питания.

Основы рационального питания. Витамины.

Существуют определенные требования, предъявляемые к рациональному питанию человека, которые обеспечивают нормальное протекание биохимических процессов в его организме. Пища должна содержать следующие компоненты: незаменимые аминокислоты и высшие жирные кислоты (линолевая, линоленовая, арахидоновая), витамины и витаминоподобные вещества, минеральные компоненты пищи (макро- и микроэлементы), клетчатку (целлюлоза, пектин, лигнин), воду.

Количество калорий, необходимое человеку, зависит от многих факторов (возраста, пола, типа нервной деятельности, профессии, беременности, лактации и т. д.) и в среднем должно составлять 2200 - 3000 ккал (9200 – 12600 кДж). Несоответствие потребляемых с пищей калорий жизнедеятельности человека может приводить к снижению или, наоборот, увеличению массы тела: избыточное потребление пищи может привести к ожирению, а недостаточное – к истощению.

Установлено, что пища должна содержать рациональное (оптимальное) соотношение белков, жиров и углеводов, которое распределяется таким образом: основная часть потребляемой пищи приходится на углеводы (58%), 30% составляют липиды и 12% белки.

Суточная потребность в углеводах составляет около 400 г. Они являются основным энергетическим материалом, легко метаболизируются (требуют малых затрат кислорода) и конечные продукты обмена (Н₂О и СО₂) не токсичны_. Однако они мало содержат незаменимых компонентов, а при изменении рациональной доли поли- и моносахаров в питании возникают нарушения в метаболизме и развитие различных заболеваний.

Суточная потребность в липидах составляет 80 — 100 г. Рациональное соотношение жидких и твердых жиров в питании людей ≈50/50 (около 20 –25 г в сутки должно быть растительных липидов, содержащих ненасыщенные жирные кислоты). Липиды являются наиболее энергоемким компонентом пищи, источником незаменимых жирных кислот и биологически активных веществ (эйкозаноидов). Однако для их окисления требуется много кислорода. Избыток липидов в пище ведет к нарушению их обмена и развитию ряда заболеваний (атеросклероз, ИБС, ожирение).

Суточная потребность в белке определяется возрастом, профессией, состоянием организма и составляет ≈ 0,75 г/кг массы тела, причем из них половина должна быть животного происхождения. Белки – это источник азота, незаменимых аминокислот, энергии, но они сложно метаболизируются, а конечные продукты их распада – аммиак и мочевина – весьма токсичны.

Большое значение отводится режиму приема пищи (2-х, 3-х, 4-х разовое питание) и дробности поступления пищи (утро – день – вечер), что обуславливает необходимую секрецию ферментов для ее переваривания. Следует также учитывать индивидуальные привычки и национальные традиции в питании, а также адекватность состава пищи состоянию организма. Например, больным сахарным диабетом необходимо ограничивать потребление углеводов, при заболевании печени и почек необходимо ограничение потребления белков, при атеросклерозе и ИБС – липидов.

Метаболизм этилового спирта включает следующие основные реакции: преобразование этанола в уксусный альдегид при участии алкогольдегидрогеназы (кофермент НАД) и дальнейшее окисление уксусного альдегида в уксусную кислоту под действием ацетальдегиддегидрогеназы (кофермент НАД). Уксусная кислота превращается в свою активную форму – ацетил-КоА, который может окисляться в цикле Кребса. В связи с простотой метаболизма этилового спирта (необходимо всего два фермента для его окисления до ацетил-КоА) клетки предпочитают легкий способ производства энергии из этого продукта, что ведет к их привыканию к этанолу и, в конечном итоге, к зависимости организма от поступления с пищей алкогольных напитков. При злоупотреблении спиртными напитками нарастает дефицит поступления в организм незаменимых компонентов пищи (незаменимых аминокислот, высших жирных кислот, витаминов, минеральных веществ и клетчатки). Алкогольдегидрогеназа и ацетальдегиддегидрогеназа, конкурируя с другими энзимами за НАД, тормозят многие реакции окисления веществ в клетке. Нарушаются обмены белков, углеводов, фосфолипидов (усиливается распад белков, снижается скорость глюконеогенеза – возникает гипогликемия, интенсивно синтезируются только триглицериды - в результате развивается жировая дистрофия печени).

Витамины отличаются от других органических веществ тем, что они не включаются в структуру тканей, не используются в качестве источника энергии, чаще всего выполняют роль коферментов в составе ферментов (B₁, B₂, B₃, B₅ и др.) или другие специальные функции (A, D, E, K). Витамины в организме превращаются в кофермент, который связывается с апоферментом и образуется активный фермент. Источники витаминов для человека: пищевые продукты; синтез микрофлорой кишечника (K, B₁, B₃, B₆, B₉, H). Провитамины – предшественники витаминов. Витамин A (ретинол) образуется в клетках тонкого кишечника из β-каротина (провитамин). Витамин D₃ (холекальциферол) образуется в клетках кожи из 7-дегидрохолестерина (провитамин).

Антивитамины – по механизму действия это 1) структурные аналоги витаминов, которые конкурируют за связывание с определенным ферментом, например, дикумарол – антивитамин K, снижает свертываемость крови; 2) вещества, которые связывают витамины и не дают образоваться активному ферменту, например, авидин; 3) вещества, которые разрушают витамины, например фермент тиаминаза разрушает витамин B₁ (тиамин)

Классификация витаминов

I Жирорастворимые

II Водорастворимые

III Витаминоподобные вещества (синтезируются из промежуточных продуктов обмена веществ и выполняют функции, сходные с витаминами)

 

 

Жирорастворимые витамины:

- A (антиксерофтальмический), ретинол

- D (антирахитический), кальциферолы

- K (антигеморрарический), нафтохиноны

- E (витамин размножения), токоферолы

 

Водорастворимые витамины:

- B₁ (антиневритный), тиамин

- B₂ (витамин роста), рибофлавин

- B₃ (антидерматитный), пантотеновая кислота

- B₅ (PP – антипеллагрический), никотинамид

- B₆ (антидерматитный), пиридосин

- B₉ (антианемический), фолиевая кислота

- B₁₂ (антианемический), кобаламин

- H (антисеборейный), биотин

- C (антискорбутный), аскорбиновая кислота

- P (капилляроукрепляющий), биофлавоноиды

 

Витаминоподобные вещества («витамины»):

- F (линолевая, линоленовая, арахидоновая кислоты)

- B₄ (холин)

- B₈ (инозит)

- B₁₃ (оротовая кислота)

- B₁₅ (пангамовая кислота)

- Bт (карнитин)

- N (липоевая кислота)

- коэнзим Q (убихинон)

- Парааминобензойная кислота

- U (S-метил-метионин – противоязвенный фактор)

 

Водорастворимые витамины

Название	Суточная потребность, мг	Кофермент-ная форма	Биологические функции	Характер-ные признаки авитаминозов
В1 (тиамин)	2-3	ТДФ	Декарбоксилирование а-кетокислот, перенос активного альдегида (транскетолаза)	Полиневрит
В 2 (рибофлавин)	1,8-2,6	ФАД ФМН	В составе дыхательных ферментов, перенос водорода	Поражение глаз (кератиты, ката­ракта)
В3 (пантотено-вая кислота)	10-12	KoA-SH	Транспорт ацильных групп	Дистрофии-ческие изменения в надпочеч-никах и нервной ткани
В6 (пиридоксин)	2-3	ПФ (пиридоксаль-фосфат)	Обмен аминокислот (трансаминирование, декар­боксилирование)	Повышенная возбуди-мость нервной системы, дерматиты
РР (ниацин)	15-25	НАД НАДФ	Акцепторы и переносчики водорода	Симметрич-ный дерматит на открытых участках тела, деменция и диарея
Н (биотин)	0,01-0,02	Биотин	Фиксация С02, реакции карбоксилирования (например, пирувата и ацетил-КоА)	Дерматиты, сопровождающиеся усиленной деятельнос-тью сальных желёз
В9 (фолиевая кислота)	0,05-0,4	Тетрагидро-фолиевая кислота	Транспорт одноуглеродных групп	Нарушения кроветворения (анемия, лей­копении)
В12 (кобаламин)	0,001-0,002	Дезоксиаде-нозил- и метилкобала-мин	Транспорт метильных групп	Макроцитарная анемия
С (аскорбино-вая кислота)	50-75		Гидроксилирование пролина, лизина (синтез коллагена), антиоксидант	Кровоточи-вость дёсен, расшатыва-ние зубов, подкожные кровоизлия-ния, отёки
Р (рутин)	Не установлена		Вместе с витамином С уча­ствует в окислительно-вос­становительных процессах, тормозит действие гиалуронидазы	Кровоточи-вость дёсен и точечные кровоизлия-ния

Жирорастворимые витамины

Название	Суточная потребность, мг	Биологические функции	Характерные признаки авитаминозов
А (ретинол)	1-2,5	Участвует в акте зрения, регулирует рост и дифференцировку клеток	Гемералопия (куриная слепота), ксерофтальмия, кератомаляция, кератоз эпителиальных клеток
D (кальциферол)	0,012-0,025	Регуляция обмена фосфора и кальция в организме	Рахит
Е (токоферол)		Антиоксидант; регулирует интенсивность свободнорадикальных реакций в клетке	Недостаточно изучены; известно положительное влияние на развитие беременности и при лечении бесплодия
К (нафтохинон)	1-2	Участвует в активации факторов свёртывания крови: II, VII, IX, XI	Нарушение свёртывающей системы крови

 

Цикл трикарбоновых кислот

Круговорот веществ. В природе существует единый цикл жизни. Фотосинтезирующие клетки растений (аутотрофы) улавливают солнечную энергию и используют её на превращения неорганических веществ — СО₂, Н₂О, N, S в разнообразные, богатые энергией органические соединения (белки, липиды, углеводы). Эти органические молекулы являются пищей для гетеротрофов (животные, человек). Поступая в их организм, они расщепляются с выделением энергии и образованием простых молекул (СО_2, Н₂О, и мочевины). Попадая в окружающую среду, эти молекулы ассимилируются растениями, и цикл жизни повторяется.

Метаболизм – это совокупность всех биохимических реакций в организме (анаболизма и катаболизма), сопровождающаяся обменом энергии. Анаболизм – совокупность биохимических реакций, в результате которых из простых веществ образуются более сложные, что сопровождается затратой энергии. Катаболизм – совокупность биохимических реакций, в результате которых из сложных веществ образуются простые и происходит выделение энергии.

Катаболизм веществ в организме человека условно делят на 3 фазы. I фаза — подготовительная (в желудочно-кишечном тракте) — перевод пищевых или внутриклеточных биополимеров в мономеры, в результате чего происходит разрушение видовой и антигенной специфичности компонентов пищи. II фаза — (в цитоплазме клеток и в митохондриях) — образование из аминокислот, моносахаров и высших жирных кислот универсального субстрата для ЦТК — ацетил-КоА. III фаза — (в митохондриях) — полное окисление ацетил–КоА в цикле Кребса до СО₂и перенос протонов и электронов с помощью НАД- и ФАД-зависимых дегидрогеназ в дыхательную цепь, а затем на кислород с целью образования АТФ (окислительное фосфорилирование) и тепла.

Процесс анаболизма также имеет 3 основные фазы, но анаболические реакции не являются обратным реакциям катаболизма, поскольку имеют различную внутриклеточную локализацию, другие регуляторные ферменты и протекают с затратой энергии. Взаимосвязь между процессами катаболизма и анаболизма осуществляется через АТФ, который является универсальным макроэргом в клетках живых организмов. Его молекула служит звеном, связывающим между собой различные виды трансформации энергии: химические, механические, электрические, осмотические и другие процессы, идущие с выделением и потреблением энергии. Макроэргическими соединениями называют вещества, аккумулирующие энергию. Эта энергия используется для удовлетворения энергетических потребностей клетки.

Цикл Кребса (цикл трикарбоновых кислот, ЦТК) — это циклическая система реакций. ЦТК начинается с взаимодействия ацетил-КоА и оксалоацетата (щавелевоуксусной кислоты - ЩУК) с образованием лимонной кислоты (цитрата). Через ряд реакций образуется снова ЩУК, но в ходе этих реакций молекула ацетил-КоА окисляется до 2 СО₂. При этом коферменты 3 НАД и 1 ФАД восстанавливаются до 3 НАД∙Н+Н⁺ и ФАД∙Н₂. При окислении 3 НАД∙Н+Н⁺ и ФАД∙Н₂ в дыхательной цепи образуется 11 АТФ (окислительное фосфорилирование); за счет субстратного фосфорилирования синтезируется 1 ГТФ (=1АТФ), и в целом получается 12 АТФ как суммарный энергетический итог ЦТК. ЦТК выполняет также интегративную функцию, объединяя пути катаболизма и анаболизма углеводов, липидов и белков. Субстраты и восстановленные коферменты ЦТК используются для синтеза других веществ, например, из ЩУК образуется аспартат и глюкоза, из сукцинил-КоА – гем и т.д. Регуляция цикла Кребса осуществляется изменением соотношений АТФ/АДФ и НАДН₂/НАД⁺: увеличение в клетке содержания АТФ и НАДН₂ ингибируют, а АДФ и НАД⁺ - активируют основные регуляторные ферменты цикла (цитратсинтетазу, изоцитратдегидрогеназу, α-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс).