Определение содержания глюкозы в крови глюкозооксидазным методом.

Принцип метода. Ферментативный метод определения глюкозы основан на действии глюкозооксидазы и предназначен для специфического определения глюкозы в биологических жидкостях в присутствии различных сахаров и других редуцирующих веществ неуглеводной природы. Глюкозооксидаза (КФ 1.1.3.4) относится к флавопротеинам (кофермент – ФАД). Глюкоза окисляется при действии фермента с образованием Н₂О₂ и глюконата. Возникшую перекись водорода определяют реакцией, катализируемой ферментом пероксидазой, с последующим окислительным азосочетанием производного фенола с 4-аминофеназоном (хромогенный кислородный акцептор). В ходе реакции образуются окрашенные в розовый цвет продукты. Количественное определение глюкозы заключается в измерении интенсивности окраски красителя и сравнении оптической плотности испытуемой пробы с окраской калибровочного раствора глюкозы.

Порядок выполнения работы:

1). В пробирку №1 (опыт) вносят 0,01 мл сыворотки крови и 1 мл рабочего раствора

(ферментно - хромогенная смесь)

2). В пробирку №2 (контроль) вносят 0,01 мл стандартного раствора глюкозы

(концентрация глюкозы 10 ммоль/л) и 1 мл рабочего раствора

3) Пробирки перемешивают и инкубируют в термостате 30 минут при 37^оС

4) Измеряют оптическую плотность опытной пробы (А_опыта) и контроля (А_{контроля})

на ФЭКе против Н₂О _дистил при длине волны 540 нм

5) Рассчитывают содержание глюкозы по формуле:

Глюкоза (ммоль/л) = (10×А_опыта): А_{контроля}

В выводах сопоставить величины нормального содержанию глюкозы в крови с данными, полученными в результате проделанной работы.

Клинико-диагностическое значение. Благодаря существованию сложных регуляторных механизмов, концентрация глюкозы в крови сохраняется относительно постоянной – 3.3-5.5 ммоль/л. Концентрация глюкозы в крови зависит от строгой регуляции интенсивности процессов распада и синтеза гликогена, глюконеогенеза, скорости всасывания глюкозы в ЖКТ и окисления ее в тканях с высвобождением энергии.

Гипогликемия – понижение содержания глюкозы в крови. Гипогликемия наблюдается при длительном голодании; сопровождает заболевания поджелудочной железы, опухолевый рост, тяжелые поражения печени, эндокринные нарушения; наблюдается при передозировке инсулина. При гипогликемии ниже 2.7 ммоль/л возникает риск развития гипогликемической комы.

Гипергликемия – повышенное содержание глюкозы в крови (более 6 ммоль/л). Физиологическая гипергликемия наблюдается после приема пищи, при эмоциональном стрессе. Гипергликемия сопровождает эндокринные нарушения (сахарный диабет, гипертиреоз), острый и хронический панкреатиты, заболевания печени, сердечно-сосудистые заболевания и др. При гипергликемии выше 22 ммоль/л развивается гипергликемическая кома.

Глюкозотолерантный тест

(метод «сахарной нагрузки» или построение «сахарных кривых»)

Принцип метода: Глюкозотолерантный тест – оценка углеводного обмена, основанная на определении уровня глюкозы в крови натощак и после нагрузки. Тест позволяет выявлять скрытые формы сахарного диабета и нарушение толерантности к глюкозе.

Порядок выполнения работы:

1. Первоначально определяют концентрацию глюкозы в крови натощак

Проведение глюкозотолерантного теста возможно только при условии, что результат исследования глюкозы натощак не превышает 6,7 ммоль/л. Подобное ограничение связано с повышением риска возникновения гипергликемической комы при нагрузке.

2. Пациент употребляет около 75 г глюкозы, которая растворена в 200 мл воды (из расчета 1 г/кг массы тела).

3. Через 30, 60, 90 и 120 минут после нагрузки проводят забор крови и определяют концентрацию глюкозы.

4. Результаты определения используются дл построения гликемическихкривых:

У здорово­го человека после приема глюкозы на­блюдается увеличение ее содержания в крови, которое между 30-й и 60-й минутой достигает максимальной ве­личины. Затем начинается снижение и к 120-й минуте содержание глюкозы достигает исходного уровня, отмечавшегося натощак или с небольшими отклонениями в сторону, как повышения, так и снижения. Через 3 ч со­держание сахара в крови достигает исходной цифры. У больных сахарным диабетом отмечается повы­шенный исходный уровень глюкозы и высокая гипергликемия (свыше 8 ммоль/л) уже через час после сахарной нагрузки. Уровень глюкозы остается высоким (свыше 6 ммоль/л) в течение всего второго часа и к концу исследования (через 3 ч) не возвращается к исходному уровню. Одновременно отмечается глюкозурия.

Интерпретация результатов глюкозотолерантного теста:

 

Время	Концентрация глюкозы в крови
Толерантностьв норме	Толерантность снижена	Сахарный диабет
Натощак	Норма	< 6,7 ммоль/л	³ 6,7 ммоль/л
Через 1 час после нагрузки	Концентрация глюкозы увеличивается на 30-40%	Концентрация глюкозы увеличивается на 80-100%	Концентрация глюкозы увеличивается на 80-100%
Через 2 часа после нагрузки	Концентрация глюкозы приходит в норму	7,8 – 10,0 ммоль/л	³ 11,1 ммоль/л
Глюкозурия	нет	может быть	есть

Повышение толерантности наблюдается при:

· низкой скорости всасывания глюкозы в ЖКТ, обусловленной его заболеваниями;

· гипотиреозе; гипофункции надпочечников;

· избыточной секреции инсулина поджелудочной железой.

Понижение толерантности наблюдается при:

· неспособности организма утилизировать глюкозу (сахарный диабет);

· тиреотоксикозе; гиперфункции надпочечников (стероидный диабет);

· поражении гипоталамической области;

· беременности;

· общей интоксикации при инфекционных заболеваниях;

· поражении почек.

 

Задания для контроля уровня сформированности компетенций в учебное время:

1. Назовите основные регуляторные механизмы, участвующие в обмене углеводов.

2. В чем проявляется влияние инсулина на обмен углеводов?

3. Как действуют на обмен углеводов адреналин, глюкагон, АКТГ, глюкокортикоиды?

4. Дайте характеристику гипергликемии, глюкозурии, гипоглике­мии.

5. Каковы основные причины сахарного диабета?

6. Назовите биохимические изменения при сахарном диабете.

7. Почему при лечении сахарного диабета введение инсулина рекомендуется сочетать с глюкозой?

 

Учебно-материальное обеспечение:

1. Химическая посуда, реактивы

2. Кровь (имитация)

3. ФЭК (фотоэлектроколориметр)

Литература:

1. Основная.

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. - 3-е изд. 2008, М.: ОАО "Медицина"

2. Биологическая химия: Учебник/Е.С, Северин, Т.Л. Алейникова и др.- М.: ООО

«Медицинское информационное агентство», 2008. - 368 с.

3. Биохимия с упражнениями и задачами: Учебник/Под ред. Е.С.Северина.- М.: «ГЭОТАР», 2008 – 384 с.

4. Биохимия с упражнениями и задачами: Учебник/Под ред. Е.С.Северина.- М.: «ГЭОТАР», 2011 – 624 с.

5. Биохимия: учебник для вузов/под ред. Е.С. Северина - М.: «ГЭОТАР», 5-е изд. 2013 – 624 с.

6. Биохимия: учебник для вузов/под ред. Е.С. Северина - М.: «ГЭОТАР», 5-е изд. Исп. 2015 – 768 с.

7. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: «Медицинское информационное агентство».– 2007. -566 с.

 

2. Дополнительная.

1. Хасина М.А. Словарь - справочник по клинической биохимии – Владивосток: «Медицина ДВ», 2008.

2. Хасина М.А., Артюкова О.А., Хасина М.Ю. Витамины и минеральные вещества в жизни человека –

Владивосток: «Медицина ДВ», 2008.-100 с.

3. Дэвид Нельсон, Майкл Кокс Основы биохимии Ленинджера: в 3 томах. Том 1.

Основы биохимии строения и катализ.- М.: Бином. Лаборатория знаний.- 2011- 694 с.

4. Солвей Дж. Г. Наглядная медицинская биохимия: учебное пособие/под ред. Е.С. Северина.-

М.: «ГЭОТАР-Медиа», 2011. – 136 с.

3. Интернет-ресурсы.

1. ЭБС «Консультант студента» http://studmedlib.ru

2. ЭБС «Университетская библиотека online» http://www.biblioclub.ru/

3. http://www.chem.msu.su/rus/teaching/kolman/index.htm

4. http://www.biochemistry.ru/biohimija_severina/B5873Content.html

5. http://biochemistry.ru/Biologicheskajahimija2011/#/1/

6.http://vk.com/biochemik

7.http://biokhimija.ru/lekcii-po-biohimii.html

 

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

 

Кафедра Общей и биологической химии

 

УТВЕРЖДЕНО на заседании кафедры протокол № 14 от «27» июня 2016 г. Заведующий кафедрой доц. Н.С.Иванова

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СТУДЕНТОВ

к практическим занятиям