Полиэлектролиты. Белки. Изоэлектрическая точка

Полимеры, макромолекулы которых содержат ионогенные группы, называются полиэлектролитами. В зависимости от природы ионогенных групп различают поликислоты, полиоснованияи полиамфолиты(последние содержат как кислотные, так и оснóвные группы). В водном растворе из-за диссоциации полярных групп макромолекула полиэлектролита существует в форме полииона, окружённого эквивалентным количеством малых противоионов. Сильные полиэлектролиты, например, полиэтилендисульфокислота в водных растворах, полностью ионизованы. У слабых полиэлектролитов, например полиакриловой кислоты, степень диссоциации полярных групп, а значит, и величина заряда, зависит от рН.

Полиэлектролиты могут быть растворимыми в воде, и нерастворимыми, как, например, белок кератин или синтетические ионообменные смолы. Применяются полиэлектролиты в качестве ионообменников, ПАВ, структурообразователей, загустителей и др. К полиэлектролитам относятся и важнейшие биополимеры- нуклеиновые кислоты, полипептиды и белки. Кроме того, что белки являются одним из основных компонентов живых организмов и важнейшим пищевым продуктом, они используются и в фармации в качестве лекарственных средств, составных частей кровезаменителей, стабилизаторов коллоидных лекарственных форм и т. д.

Особенности поведения полиэлектролитов в растворах обусловлены наличием электростатических взаимодействий: отталкиванием одноимённо заряженных групп в макромолекуле и притяжением низкомолекулярных противоионов к полииону. Отталкивание усиливается при разбавлении бессолевых растворов полиэлектролитов водой вследствие уменьшения экранирования заряженных групп противоионами. В результате полиионы, свёрнутые в клубок, распрямляются.

Белкиот синтетических полиамфолитовотличаются сравнительно невысокой плотностью полярных групп в макромолекулах. Так как белки состоят из остатков ами­но­кислот, их полярные группы - это, главным образом, -NH₃⁺ (оснóвные) и -СОО^- (кислотные) группы. В зависимости от рН среды эти группы могут быть ионизованы в различной степени. Так, в кислой среде подавляется ионизация карбоксильных групп, и макромолекулы существуют в виде полимерных катионов. В щелочной среде, наоборот, подавляется ионизация аминогрупп, что приводит к возникновению полимерных анионов.

При определённых значениях концентрации водородных ионов количества ионизированных основных и кислотных групп могут оказаться равными, причём количество тех и других в каждой макромолекуле является минимальным. Такое состояние белка называется изоэлектрическим, а значение рН, при котором система находится в изоэлектрическом состоянии, называется изоэлектрической точкой (ИЭТ, ИТ, pI). В ИЭТ макромолекула белка представляет собой амфиион (цвиттер-ион), строение которого можно изобразить так:

В макромолекулах большинства белков содержится больше способных к диссоциации карбоксильных групп, чем аминогрупп. Поэтому белки, как правило, являются более сильными кислотами, чем основаниями, и их изоэлектрическая точка обычно меньше 7. Но имеются и такие белки, изоэлектрическая точка которых > 7. Причём у каждого белка значение ИЭТ обычно соответствует рН среды, в которой функционирует белок. Отсюда следует, что белки проявляют наилучшую жизнедеятельность тогда, когда они находятся в изоэлектричсском состоянии. В частности, с этим связано буферное действие сред организма, поддерживающее необходимое для нормального функционирования белков значение рН среды.

10.7.1. Методы определения изоэлектрической точки белков

Изоэлектрическая точка- одна из важнейших характеристик белка. Все существующие методы её определения основаны на измерении свойств белков, связанных или с конформацией макромолекулы, или с их зарядом, при различных значениях рН. Во всех случаях готовится серия буферных растворов с различными значениями рН, в которые помещаются одинаковые количества исследуемого белка в виде раствора или в сухом виде.

Электрофоретический метод. Так как само выражение "изоэлектрическое состояние" говорит о равенстве числа положительных и отрицательных зарядов в амфиионах, ИЭТ можно определить с помощью электрофореза на бумаге, который проводится так. В прибор для электрофореза на бумаге вставляется несколько полосок фильтровальной или специальной хроматографической бумаги и каждая из них смачивается буферным раствором с определённым значением рН. На заранее отмеченное карандашом место в середине полосок пипеткой наносится капля раствора исследуемого белка. После этого прибор включается и через полоски бумаги с растворами проходит постоянный электрический ток.

В зависимости от рН буферного раствора макромолекулы изменяют свой заряд. В средах с рН > ИЭТ они заряжаются отрицательно:

NH3+ NH2 R + OH- «R COO- COO-,

а в средах с рН < ИЭТ – положительно:

NH3+ NH3+ R + H+ «R COO- COOH.

В растворе с рН, равным ИЭТ, макромолекулы белка приобретут нейтральный заряд. Таким образом, в электрическом поле макроионы будут перемещаться в различных направлениях, а нейтральные цвиттер-ионы останутся на месте в соответствии со схемой:

Через какое-то время ток выключают, полоски бумаги высушивают и проявляют пятна белка, опрыскивая их раствором нингидрина. рН буферного раствора той полоски, на которой пятно белка осталось в том же месте, куда была нанесена капля, соответствует изоэлектрической точке белка.

Метод электрофореза может быть использован и для тонкого фракционирования белков. Так, например, можно разделить a-, b- и g-глобулины плазмы крови. поскольку каждый из них обладает своим значением ИЭТ, то степень их заряда в одном и том же буферном растворе будет различна. Поэтому каждая из этих фракций белков будет обладать своей скоростью движения в электрическом поле, что через определённое время приведёт к их разделению. Пятна каждой фракции, проявленные, например, с помощью люминесценции, вырезаются из полоски бумаги, вымываются соответствующим растворителем и при необходимости высушиваются.

В изоэлектрическом состоянии макромолекулы из-за минимального заряда обычно свернуты в клубки и наименее гидратированы. Это лежит в основе других методов, из которых наиболее надёжным и простым в исполнении является метод определения ИЭТ по минимуму вязкости. В этом случае с помощью вискозиметра измеряется относительная вязкость серии буферных растворов с добавлением одинакового количества белка. Из-за свёрнутости макромолекул белка, находящегося в изоэлектрическом состоянии, в наиболее плотные глобулы, наименьшей вязкостью будет обладать раствор с рН = ИЭТ.

Метод, связанный с действием водоотнимающих средств. Макромолекулы белков в изоэлектрическом состоянии наименее всего гидратированы. Поэтому выделение белков из раствора под действием водоотнимающих средств (например, спирт, ацетон в чистом виде или в присутствии нейтральных солей) происходит быстрее и полнее всего при рН, соответствующем изоэлектрической точке.

В принципе изоточка может быть определена и другими способами – по скорости застудневания, по степени набухания сухого белка и т. д. Однако эти методы не очень точны и требуют намного большего количества белка для исследования, что не всегда доступно.