Общие представления и классификация хроматографических методов

Хроматография – это метод разделения, анализа и физико-химического исследования веществ. Основана хроматография на различии в скоростях дви­жения концентрационных зон исследуемых компонентов, которые перемещаются в потоке подвижной фазы (элюента) вдоль слоя неподвижной, причём исследуемые соединения распределены между обеими фазами. Обычно неподвижная фаза представляет собой сорбент с развитой поверхностью (порошкообразный или пористый), а подвижная - поток газа или жидкости, фильтрующийся через слой сорбента.

Открытие хроматографии как метода разделения веществ принадлежит российскому ботанику М. С. Цвету, который в 1903 г. опубликовал работу, посвящённую хроматографическому анализу хлорофилла. Ему принадлежит и термин «хроматография» (в переводе с греческого «цветописание»), хотя он уже тогда указывал на возможность разделения этим методом и бесцветных веществ.

В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы различают:

1) газовую хроматографию,которую делят на газо-адсорбционную и гаэо-жидкостную и 2) жидкостную хроматографию.

- По геометрии сорбционного слоя неподвижной фазы различают колоночную и плоскослойную хроматографию. К плоскослойной относятся тоикослойная н хроматография на бумаге.

- По механизму разделения различают адсорбционную, распределитель ную, осадочную, ионообменную, аффинную хроматографию и др.

В зависимости от способа перемещения разделяемой смеси в колонке различают следующие варианты хроматографии: проявительный, фронтальный и вытеснительный. В наиболее часто используемой проявительной хроматографии анализируемую смесь периодически вводят в поток подвижной фазы; в колонке смесь разделяется на отдельные компоненты, между которыми находятся зоны подвижной фазы. Во фронтальном варианте подвижная фаза с разделяемыми веществами непрерывно поступает в колонку; при этом только первый, наименее сорбируемьй компонент можно получить в чистом виде. Вторая и последующие зоны содержат два и более компонентов. При вытеснительиой хроматографии в колонку после разделяемой смеси

вводят так называемый вытеснитель, который сорбируетея лучше любого из анализируемых компонентов. Это приводит к образованию примыкающих друг к другу зон разделяемых веществ.

 

Газовая хроматография

Подвижной фазой в газовой хроматографииявляется газ или пар (точнее, смесь газов или паров). Основой газовой смеси является газ-носитель, обладающий низкой вязкостью и химической нейтральностью (воздух, углекислый газ, азот, аргон и др.). Неподвижной фазой в газо-адсорбционной хроматографии служит твёрдое тело (пористое, как, например, силикагель, или спрессованный порошок). В газо-жидкостной хроматографии неподвижная фаза представляет собой жидкость, нанесённую тонким слоем на твёрдый носитель. Разделение движущихся в газовом потоке веществ основано на различном распределении компонентов между газовой и неподвижной фазами, которое приводит к различной скорости их движения.

Газохроматографическое разделение проводится с помощью специальных приборов – газовых хроматографов. Проба разделяемой смеси (в виде небольшого объёма раствора) вводится дозатором (например, шприцем, через резиновую мембрану) в поток газа, где она испаряется и переносится в термостатированную хроматографическую колонку. Колонки в зависимости от целей исследования могут быть насадочными (насадка – цилиндр из специально подготовленного твёрдого пористого или порошкообразного материала - цеолита, силикагеля или др.) и капиллярными, т. е. изготовленными в виде спирально изогнутого капилляра с диаметром 0,1 – 1 мм и длиной 10 – 100 м. В результате замедления скорости движения компонентов в колонке на выходе из неё регистрируются зоны, обогащённые соответствующими компонентами. Эти зоны с потоком газа поступают в детектор, где проводится их регистрация, чаще всего дифференциальная. Регистрацию осуществляют различными приборами (пламенно-фотометрическим, пламенно-иони­за­ци­он­ным, электронно-захватным и др. детекторами). Использование в качестве детектора масс-спектрометра привело к созданию высокоэффективного метода - хромато-масс-спектрометрии. Детектор автоматически записывает зависимость интенсивности сигнала от времени. Полученная диаграмма называется хроматограммой.

Жидкостная хроматография

Жидкостная хроматография– один из важнейших методов исследования. Так, в химии, биологии, медицине она используется для разделения, очистки и анализа биологически активных веществ – аминокислот, белков, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов, гормонов, витаминов и т. п., для изучения метаболизма ксенобиотиков в живых организмах. Незаменима хроматография при идентификации и очистке вновь синтезированных или выделенных из растительного сырья лекарственных веществ. Используется жидкостная хроматография и в препаративных целях.

 

Адсорбционная хроматография

 

Принцип этого метода основан на различии в адсорбционнойспособности веществ, которая обусловлена как природой адсорбируемых веществ, так и природой адеорбентов. Различные вещества на одном и том же адсорбенте адсорбируются в разной степени, т. е. прочность связывания и время установления адсорбционно-десорбционного равновесия у них различны.

В процессе прохождения смеси веществ через слой сорбента непрерывно совершаются акты адсорбции - десорбции, в результате которых сильно сорбирующиеся вещества, дольше удерживаются на поверхности сорбента и «отстают» от слабо сорбирующихся. Поэтому раньше выходить из слоя сорбента будут те компоненты, которые сорбируются слабее. Очевидно, что чем толще слой адсорбента, тем полнее будет разделение компонентов смеси.

Сорбентом чаще всего служит силикагель, чистый или химически модифицированный, активированные угли, оксид алюминия, а также полимерные материалы. Элюенты должны быть химически инертными по отношению к исследуемым веществам, по возможности нетоксичными и совместимыми с методами детектирования. Кроме того, необходимой характеристикой элюента является малая вязкость. Обычно в качестве элюентов используют углеводороды, часто с добавками изопропилового спирта, хлороформа или других веществ. Возможно использование и смесей воды с органическими жидкостями различной природы.

Колоночная адсорбционная хроматография проводится на колонках, представляющих собой длинную стеклянную трубку или бюретку, заполненную равномерно уплотнённым слоем тонко измельчённого порошкообразного сорбента (окись алюминия, мел, силикагель, целлюлоза, полиамиды и др.). Разделяемая смесь обычно подается сверху, причём скорость её прохождения можно регулировать. Если на сухой колонке разделяется газовая смесь, то мы дело с газо-адсорбционной хроматографией, если разделяется жидкая смесь (раствор), то – с жидкостной, а в том случае, когда газовая смесь проходит через слой твёрдого сорбента, смоченного каким-либо растворителем, - с газожидкостной хроматографией.

Если разделяемые компоненты смеси окрашены в различные цвета, как, например, в случае смеси растительных пигментов или солей переходных металлов, в колонке будут видны более или менее чётко отделённые друг от друга цветные зоны, соответствующие каждому компоненту. В случае бесцветных компонентов зоны могут быть проявлены с помощью цветных реакций, ультрафиолетового облучения (по характерному спектру люминесценции) и т. п.

При дальнейшем пропускании газа или растворителя (элюента) через колонку зоны всё больше будут отделяться друг от друга, одновременно смещаясь вниз, и рано или поздно будут выходить (элюироваться) из нижней части колонки. При этом их можно по отдельности собирать и анализировать.

В настоящее время хроматография обычно осуществляется с помощью специальных приборов - хроматографов, основные части которых - хроматографическая колонка и детектор, который на выходе из колонки автоматически непрерывно определяет концентрацию разделяемых соединений в подвижной фазе. Сигнал детектора, как правило, регистрируется самописцем. Полученная диаграмма называется хроматограммой. Современные хроматографы в варианте высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) обладают очень большой чувствительностью и малой погрешностью измерения.

Кроме разделения и анализа колоночная хроматография используется для наработки значительных количеств чистых веществ, обычно содержащих не более 0,1% примесей (препаративная хроматография).

Тонкослойная хроматография отличается от колоночной тем, что анализируемая смесь веществ разделяется в плоском тонком слое сорбента, нанесённом на инертный носитель - стеклянную или металлическую (например, алюминиевую) пластинку. Промышленным способом производятся пластины с закреплённым слоем сорбента. Капля анализируемой смеси наносится пипеткой на отмеченное место пластинки; нижний край пластинки помещается в кювету с растворителем (часто используются смеси растворителей, в том числе тройные или содержащие большее число компонентов, взятых в различных соотношениях). Чтобы предотвратить испарение растворителя, эксперимент проводят, как правило, в закрытой камере. Под действием капиллярных сил растворитель поднимается по слою сорбента и увлекает за собой компоненты разделяемой смеси. Для увеличения эффективности разделения применяют различные приёмы, в том числе повторные элюирования в том же или в перпендикулярном направлении. После окончания процесса пластинку высушивают и устанавливают положение хроматографических зон (проявляют) облучением ультрафиолетовым светом, опрыскиванием раствором окрашивающего вещества и т. п. На полученной хроматограмме зоны компонентов смеси располагаются в виде более или менее компактных пятен в соответствии с их адсорбируемостью в данной системе растворителей. Положение хроматографических зон количественно характеризуется с помощью коэффициента R_f, который равен отношению пути l_i, пройденного данным компонентом, к пути l, пройденному фронтом растворителя:

Величина R_f в данной системе растворителей является характерной константой для каждого вещества. Поэтому качественное определение (идентификацию) компонентов смеси можно проводить по значению их R_f. Количественное определение проводится снятием зон с хроматографической пластины, растворением их в подходящем растворителе и анализом любым подходящим для данной цели методом. ТСХ позволяет разделять смеси, содержащие до 30 компонентов, и анализировать их с достаточной точностью. Предел обнаружения ТСХ – от 10^-9 до 10^-5 г. Это один из наиболее распространённых физико-химических методов анализа, применяемый для разделения и анализа как неорганических, так и органических веществ, в том числе лекарственных средств, аминокислот, витаминов, ПАВ, липидов, стероидов, флавоноидов и др.